一、样本准备

详见流式细胞术样本制备技术、流式实验样本制备方法及注意事项

1. 收集细胞，200目筛网过滤，收集滤液，300 g离心5 min，弃上清。

2. 向细胞中加入适量细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)，用移液枪轻轻吹打细胞重悬。

二、细胞计数

用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后，调整细胞浓度约为1 × 10⁷/mL。

三、设置实验分组

      根据实验设计，设置实验分组，每管加入100μL细胞悬液。

四、封闭Fc受体

      封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。

      小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10min。

      对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。

五、细胞表面抗体孵育

      根据实验设计，除空白对照外，对应的单染管、全染管加入相应的抗体5μL，混匀，4℃避光孵育30min。

六、固定破膜

1. 按照说明书稀释固定破膜液。

2. 每管加入1mL细胞染色buffer，300g离心5min，弃上清。

3. 加入100μL细胞染色buffer，重悬细胞。

4. 每管加入1mL的1× Fixation Working Solution，轻柔混匀，4℃避光孵育30min。

5. 600g离心5min，弃上清。

6. 每管加入2mL的1×Permeabilization Working Solution，轻柔混匀。

7. 600g离心5min，弃上清。

8. 重复（6）、（7）步一次。

七、胞内抗体孵育

1. 加入100μl 的1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。

2. 对应的单染管、全染管加入相应的抗体5μL，混匀。

3. 室温避光孵育30分钟。

4. 加入1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。

5. 600g离心5分钟，弃上清。

八、上机检测

1. 加入200μL细胞染色buffer，重悬细胞。

2. 调整仪器参数，上机检测。