流式细胞分析

细胞内细胞因子染色步骤

2018-08-01作者:admin赞:0

一、样本准备


详见流式细胞术样本制备技术流式实验样本制备方法及注意事项

1. 收集细胞,200目筛网过滤,收集滤液,300 g离心5 min,弃上清。

2. 向细胞中加入适量细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS),用移液枪轻轻吹打细胞重悬。


二、细胞计数


用血球计数板或其他仪器对悬液进行计数后,调整细胞浓度约为1 × 107/mL。


三、设置实验分组


      根据实验设计,设置实验分组,每管加入100μL细胞悬液。


实验分组

作用

阴性/空白对照

调节仪器电压

单染/单阳对照

调节补偿

同型对照

消除背景染色

FMO对照

确定设门的准确性

生物学对照

实验结果对比

实验组

实验结果




四、封闭Fc受体

      封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色

      小鼠中,纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合,封闭非特异性染色,使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体,室温孵育10min

      对于人和大鼠,可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断,或者用商业化的Fc受体阻断剂。


五、细胞表面抗体孵育

      根据实验设计,除空白对照外,对应的单染管、全染管加入相应的抗体5μL,混匀,4℃避光孵育30min。


六、固定破膜

1. 按照说明书稀释固定破膜液。

2. 每管加入1mL细胞染色buffer,300g离心5min,弃上清。

3. 加入100μL细胞染色buffer,重悬细胞。

4. 每管加入1mL的1× Fixation Working Solution,轻柔混匀,4℃避光孵育30min。

5. 600g离心5min,弃上清。

6. 每管加入2mL的1×Permeabilization Working Solution,轻柔混匀。

7. 600g离心5min,弃上清。

8. 重复(6)、(7)步一次。


七、胞内抗体孵育

1. 加入100μl 的1×Permeabilization Working Solution,重悬细胞。

2. 对应的单染管、全染管加入相应的抗体5μL,混匀。

3. 室温避光孵育30分钟。

4. 加入1×Permeabilization Working Solution,重悬细胞。

5. 600g离心5分钟,弃上清。


八、上机检测

1. 加入200μL细胞染色buffer,重悬细胞。

2. 调整仪器参数,上机检测。