流式细胞分析

流式细胞术样本制备技术

2018-08-01作者:admin赞:15

单细胞是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。在应用流式细胞术中,制备出合格的分散单细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它既要求组织分散成为单个细胞,又要维持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。


一、流式细胞术样本制备的基本原则

1. 保证各种液体和悬浮细胞样本新鲜,尽快完成样本制备和检测。

2. 针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或者EDTA处理,以清除杂质,使黏附的细胞彼此分离形成单细胞状态。

3. 对新鲜实体瘤组织可选用酶消化法、机械打散法或化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液。

4. 对石蜡包埋组织应先切成若干40~50 μm厚的蜡片,经二甲苯脱蜡至水后,再用前述方法制备单细胞悬液。

5. 单细胞悬液的细胞数不少于107/mL。


二、流式细胞术实验操作大致分为以下五个步骤

1. 取材:取手术或活检组织必须具有代表性,如取手术肿瘤组织,必须取肿瘤细胞生长旺盛部位;组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜;一般在室温1个小时内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存。

2. 对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色。

3. 按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储。

4. 依照软件提供的程序对检测结果进行定性定量分析。

5. 检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。


三、外周血液标本的制备

a)常规血液样本制备

1. 采集外周血,用肝素抗凝;采集后室温(25℃)保存,6 h内处理;

2. 红细胞裂解液(ACK buffer)取出后,恢复至室温待用;

3. 流式管内加入200 ul外周血后,加入3 mLACK buffer,室温孵育3~5 min

4. 加入10 mL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)终止红细胞裂解;

5. 300 g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清;

6. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)重复洗涤一次;

7. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


b)外周血单个核细胞样本制备

1. 采集外周血2 mL,用肝素抗凝,用生理盐水将血液稀释成4 mL,混匀;

2. 15 mL的离心管内,先加入等体积(4 mL)的淋巴细胞分离液;

3. 将稀释后的外周血沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上,勿用力过大,以免造成血液与分离液混合。务必保持清晰的分层状态;

4. 400 g室温离心20~30 min(根据血液样本量确定离心条件,建议先摸索一下条件以达到最好的分离效果);离心后可见试管内血液清晰的分为4层,上层为血浆层,第二次为白色淋巴细胞层,第三层为透明分离液层,底层为红细胞层;

5. 用吸管将第二层的淋巴细胞层小心的吸出收集到另1试管,用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)清洗2遍,每次250 g离心10 min;

6. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


四、 骨髓细胞样本制备

a)常规骨髓细胞样本制备

1. 无菌抽取骨髓液0.5 mL,用肝素抗凝;

2. 红细胞裂解液(ACK buffer)取出后,恢复至室温待用;

3. 骨髓液中加入3 mLACK buffer,室温孵育3~5 min

4. 加入10 mL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)终止红细胞裂解;

5. 300 g离心细胞悬液5分钟,弃掉上清;

6. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)重复洗涤一次;

7. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


b)骨髓液单个核细胞样本制备

1. 无菌抽取骨髓液0.5 mL

2. 将骨髓液标本中滴入含1000 U/mL肝素抗凝剂的1 mL PBS液中;

3. 加入PBS稀释液将样本稀释至10 mL

4. 15 mL的离心管内,先加入5 mL的淋巴细胞分离液;

5. 用吸管吸取5 mL的稀释后的骨髓液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液的液面上;

6. 400 g室温离心20~30 min(根据骨髓样本量确定离心条件,建议先摸索一下条件以达到最好的分离效果);离心后可见试管内骨髓液清晰的分为4层,上层为PBS稀释液层,第二层为白色淋巴细胞层,第三层为透明分离液层 ,第四层为红细胞层;

7. 用吸管将第二层的淋巴细胞层小心的吸出收集到另1试管,用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)清洗2遍,每次300 g离心5 min;

8. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


五、体液、灌洗液或悬浮培养细胞的制备

1. 采集新鲜体液、灌洗液或悬浮培养细胞;

2. 300 g离心5 min,收集细胞沉淀;

3. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

4. 若悬液中有明显的沉淀块,需用200~300目的滤网过滤后再用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)洗涤1~2次;

5. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整浓度至1x107/mL备用。


六、贴壁细胞的制备

1. 吸除培养基上清液,用含无钙、镁离子的PBS漂洗一次;

2. 25 mL培养基为例,加入1 mL消化液(0.1%胰蛋白酶),置室温(25℃)或37℃消化2~5 min;或者加入1 mLEDTA0.02%,pH7.4)冰上静置5~10 min

3. 在倒置显微镜下观察,发现胞质回缩、间隙加大,立即吸除消化液并加入等倍体积含血清的培养基终止消化;

4. 吸取瓶内液体,反复吹打瓶壁细胞。吹打动作要轻柔并尽量避免产生泡沫;

5. 转移至离心管,300 g离心5 min,弃上清;

6. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

7. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


七、组织标本的制备

a)剪碎研磨法:

1. 将组织用PBS或无血清培养基漂洗干净;

2. 将组织置于平皿中,用眼科剪剪成小颗粒(1~2 mm3);

3. 用注射器针芯研磨成匀浆;

4. 滴加适量的PBS或无血清培养基,用移液器吹打混匀;

5. 200~300目滤网过滤,300 g离心5 min,弃上清;

6. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

7. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


b)网搓法

1. 将300目尼龙网扎在小烧杯上;

2. 把剪碎的组织放在网上,以眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边加PBS冲洗,直至将组织搓完;

3. 收集细胞悬液,300 g离心5 min,弃上清;

4. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

5. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


c)研磨法

1. 将组织剪成1~2 mm3大小的组织块;

2. 放入组织研磨器中,加入1~2 mLPBS

3. 转动研棒,研至匀浆;

4. 加入10 mLPBS,冲洗研磨器;

5. 收集细胞悬液,经200~300目尼龙网过滤,300 g离心沉淀5 min,弃上清;

6. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

7. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。

注意:1)以上方法为机械法,用于处理部分软组织例如胸腺、淋巴结等,对硬组织或纤维组织效果不好,并且对组织细胞有一定的损伤。

2)若组织为脾脏,可用研磨法处理后做红细胞裂解。在300 g离心沉淀5 min弃上清后,加入3 mLACK buffer,室温孵育3~5 min;再加入10 mL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)终止红细胞裂解;后续操作同研磨法。


d)胰蛋白酶消化法:

适用于消化间质较少的组织,如上皮、肝、肾等组织,由于钙离子或血清会抑制胰蛋白酶的消化作用,此过程中使用的液体应不含这些离子或血清。消化时间根据不同情况进行调整,温度低、组织块大、胰蛋白酶浓度低,消化时间长;反之则缩短消化时间。胰蛋白酶常与EDTA0.02%)等比例混合使用可提高消化效率。

1. 将组织块用无钙、镁离子的PBS漂洗干净;

2. 将组织置于平皿中,用眼科剪刀剪成小颗粒(1~2 mm3);

3. 加入30倍组织量的蛋白酶溶液(0.1%胰蛋白酶和0.02%EDTA等比混合);

4. 移液管转至三角烧瓶,置于37℃水浴或者恒温箱中消化20~60 min,每隔5~10 min震荡一次。若需消化较长时间,可每隔15 min2/3的消化上清液转移到离心管中冰浴或离心去除消化液,加入含血清培养基终止消化,另补充新的消化液至三角烧瓶中继续消化;

5. 将消化液或分批收集的细胞悬液经200~300目的滤网过滤,300 g离心5 min,弃上清;

6. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

7. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


e)胶原蛋白酶消化法:

此法适用于分离纤维性组织、上皮及癌组织。钙、镁离子不会抑制消化作用,因此可用PBS或含血清培养基配制以提高细胞成活率。

1. 将组织块用PBS漂洗干净;

2. 将组织置于平皿中,用眼剪刀剪成小颗粒(1~2 mm3);

3. 加入30倍组织量的蛋白酶溶液(0.1~0.3 μg/mL的胶原蛋白酶);

4. 移液管转至三角烧瓶,置于37℃水浴或者恒温箱中消化4~48 h,每隔5~10 min震荡一次。亦可每隔15 min2/3的消化上清液转移到离心管中冰浴或离心去除消化液,加入含血清培养基终止消化,另补充新的消化液至三角烧瓶中继续消化;

5. 将消化液或分批收集的细胞悬液经200~300目的滤网过滤,300 g离心5 min,弃上清;

6. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

7. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


注意以上几种为最常见的实体组织样本单细胞制备方法,机械法常常造成严重的细胞损伤,单细胞产量低;酶学法、化学法(酶和EDTA结合使用)对实体组织的分散解聚较理想,但对所测细胞化学成分可能存在不良影响,所以需结合实验目的选择合适的单细胞悬液制备方法。


八、石蜡包埋组织的流式细胞样本制备

外科手术获得的实体组织,大部分经过石蜡包埋处理。石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立,扩大了流式细胞术的应用范围。

1. 将石蜡包埋组织切成40~50 μm厚的组织切片3~5片,或者用乳钵研成0.5 mm直径大小的颗粒,放入10 mL的试管中;

2. 加入5~8 mL二甲苯,室温下脱蜡1~2天,视石蜡脱净与否,更换1~2次二甲苯,石蜡脱净后,弃去二甲苯;

3. 水化:依次加入5 mL 100%95%70%50%梯度乙醇,每次10 min

4. 去乙醇,加入蒸馏水3~5 mL10 min后弃之;

5. 消化:可加入2 mL0.5%胰蛋白酶(pH1.5~2.0)消化液,置于37℃恒温水浴中消化30 min,在此期间,每隔10 min用振荡器震荡1次;

6. 消化30 min后,加入含血清培养基终止消化;

7. 300目尼龙网过滤,未消化好的组织可进行第二次消化;

8. 收集细胞悬液,300 g离心5 min,弃上清;

9. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)离心洗涤1~2次;

10. 用细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)调整细胞浓度至1x107/mL备用。


注意事项:

1. 新鲜组织标本应及时进行处理保存,以免组织在室温下放置时间过长,产生中心组织坏死或者细胞自融,影响FCM测定结果;

2. 酶学法要注意条件的选择和影响因素,同时注意酶的溶剂、消化时间、pH值、浓度等方法对酶消化法的影响;

3. 不同的实体组织应选取不同的制备方法,如富含细胞的组织----淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样瘤以及一些软组织肉瘤等,用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞;

4. 在使用酶学方法时,应重视酶的选择,如含有大量结缔组织的肿瘤----食管癌、乳腺癌、皮肤癌等,应选用胶原酶消化。