流式细胞分析

Annexin V荧光双染细胞凋亡检测试剂盒实验操作指南

2019-03-29作者:admin赞:0

Elabscience®自主研发的荧光双染细胞凋亡检测试剂盒用于鉴定凋亡和坏死细胞。

Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力,可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合,将Annexin V标记上荧光染料利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。

由于凋亡晚期或坏死细胞膜完整性丧失,细胞核染色液可进入细胞内染色细胞核,搭配Annexin V使用可将处于不同凋亡时期的细胞区分开。


A.悬浮细胞:

1. 按照实验方案进行凋亡诱导,300g离心5min,弃上清,收集细胞,用PBS洗涤细胞一次,轻轻重悬浮细胞并计数。

2. 取1~5 × 105重悬的细胞,300g离心5min,弃上清。加入500μL稀释成1 ×的Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞。

3. 细胞悬液中加入5μL的荧光素标记-Annexin V和5μL的细胞核染色液。

4. 轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育15~20min。

5. 反应完成后立即上机检测。如不能及时检测,请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

6. 检测

1)流式细胞仪检测

处理好的样本在流式细胞仪上检测。

2)荧光显微镜分析

取一滴用荧光素-Annexin V/细胞核染色液双染的细胞悬液(E步骤处理过的细胞悬液)于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。在荧光显微镜下用双色滤光片观察。


B贴壁细胞

一、流式细胞仪检测

1. 按照实验方案进行凋亡诱导,将培养基吸出转移至干净离心管内(待用),用无钙、镁离子的PBS清洗培养瓶细胞一次。

2. 培养瓶中加入适量的胰酶消化细胞,室温孵育至轻轻吹打可使贴壁细胞脱落,吸除胰酶消化液,避免胰酶消化过度。

注意:对于贴壁细胞,胰酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,从而导致细胞坏死的假阳性;消化时间如果过长,同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳性,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-荧光素的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。同时,胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA,因为EDTA可能会影响Annexin V与磷脂酰丝氨酸的结合。

3. 加入步骤A中收集的细胞培养液,将细胞轻轻吹打下来,转移到离心管内,300g离心5min,弃上清,收集细胞,用PBS洗涤细胞一次,轻轻悬浮细胞并计数。

注意:加入细胞培养液非常重要,一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞,另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶(残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-荧光素,导致染色失败)。

4. 取1~5× 105重悬的细胞,300g离心5min,弃上清。加入500μL稀释成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞。

5. 细胞悬液中加入5μL的荧光素标记Annexin V和5μL的细胞核染色液。

6. 轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育15~20min。

7. 反应完成后立即上机检测。如不能及时检测,请于冰上避光静置并于1小时内完成检测。

8. 流式细胞仪检测。


二、荧光显微镜原位检测

注:本方法优点是可以原位观察细胞凋亡,缺点是部分凋亡由于贴壁不牢而检测不到

1. 如果条件可以,在诱导凋亡后,用多孔板离心机300g离心5min。

2. 吸除细胞培养液,用PBS洗涤两次(如果条件允许,在此前做步骤A)。

3. 离心后弃上清,加入500μL稀释成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液。

4. 加入5μL的荧光素标记-Annexin V和5μL的细胞核染色液。

5. 移液器轻轻混匀,室温避光孵育15~20min。

6. Annexin V Binding Buffer工作液洗涤细胞一次

7. 荧光显微镜检测。在荧光显微镜下用双色滤光片观察。(如果无法观察,可以在孔板下铺上玻片使细胞贴附,最后取出用Annexin V Binding Buffer浸润观察。)

8. 反应完成后应立即观察,取出贴附细胞玻片时,避免细胞干片。