流式细胞分析

细胞凋亡检测利器---TUNEL详细实验步骤

2019-07-10作者:admin赞:0

Elabscience® TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(增强型绿光,通用型)[E-CK-A334]为例

一、检测原理:

细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,剪断核小体间的基因组DNA,暴露的3’-OH可在末端脱氧核酸转移酶(TdT)的催化下加上荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷(FITC-12-dUTP),即可通过荧光显微镜直接观察。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被标记。这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

试剂盒中的增强型荧光标记液,包含FITC-12-dUTP和荧光增强型因子,荧光增强因子与FITC非共价结合,增强稳定性并放大信号,使标记的荧光更亮且抗猝灭能力更强。


二、自备试剂:

1、 细胞样本

固定液(4%多聚甲醛溶于PBS中)。

通透液(0.1%的Triton-100溶于0.1%柠檬酸钠)。

2、 石蜡切片

二甲苯、乙醇、PBS。

3、 冰冻切片

固定液(4%多聚甲醛溶于PBS中)。

4、 其他试剂 PBS、ddH2O、DAPI、含抗荧光淬灭剂的封片液。


三、产品使用说明:

蛋白酶K(100 ×)[ E-CK-A334C]为浓缩液,实验前用PBS稀释成1×蛋白酶K工作液。

例如,取1 μL蛋白酶(100 ×) [E-CK-A334C],加入到99 μL的PBS中,混匀即为1×蛋白酶工作液。


四、实验操作指南:

TUNEL检测时样本的预处理是实验的关键所在,本说明书推荐的条件为普遍情况,用户需根据自己的样本材料及首次实验结果来调整实验条件,如处理时间、浓度等,以优化出适合样本的实验条件。

1. 样本处理

A、 细胞样本

1) 细胞涂片或爬片自然晾干。

2) 晾干的样本浸入固定液,室温(15-25°C)固定15-60 min。

(固定液的配制:4%多聚甲醛溶于pH7.4PBS中,现配现用)

3) 固定好的样本浸入PBS漂洗3次,每次5 min。

4) 吸干样本周围的水分后,将样本中加入蛋白酶K工作液,20-37°C作用5 min;也可以浸于通透液中,冰上(2~8°C)促渗2 min。

(蛋白酶K工作液配制:1 μL100x蛋白酶K[E-CK-A334C]加入到99μLPBS中,混匀)

(通透液的配制:0.1%Triton-100溶于0.1%柠檬酸钠,现配现用)

注意:细胞爬片或涂片处理时容易脱片,建议使用Triton-100通透液,避免因通透导致的脱片。

5) 将样本浸入PBS漂洗3次,每次5 min。

注意:

1)  为防止样本脱落,请使用硅烷(Silane)处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。

2)  固定好的样本可在-20°C的70%乙醇中放置30 min或过夜,以改善细胞的渗透性。

3)  使用PBS漂洗细胞样本时,不要直接加在细胞样本上,以防细胞样本的脱落。

4)  固定液、PBS、封闭液、通透液和染色缸等需用户自备。

B、 石蜡切片

1) 按常规方法将石蜡切片进行脱蜡水合。

(例如:二甲苯脱蜡2次,每次5-10 min,乙醇水合(将脱蜡好的切片依次放入100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇,每次2 min))

2) 样本浸入PBS漂洗3次,每次5 min。

3) 吸干样本周围的水分后,将样本中加入蛋白酶K工作液,20-37°C作用15-30 min。

(蛋白酶K工作液配制:1 μL100x蛋白酶K[E-CK-A334C]加入到99 μLPBS中,混匀)

4) 样本浸入PBS漂洗3次,每次5 min。

注意:蛋白酶K处理的浓度和时间及温度,因组织的类型不同而有所不同,需用户摸索条件后确定.

C、 冰冻切片

1) 冰冻切片浸入固定液,室温(15-25°C)固定30 min。

(固定液的配制:4%多聚甲醛溶于pH7.4PBS中,现配现用)

2) 样本浸入PBS漂洗2次,每次5min。

3) 吸干样本周围的水分后,将样本中加入蛋白酶K工作液,20-37°C作用15-30 min。

(蛋白酶K工作液配制:1 μL100x蛋白酶K[E-CK-A334C]加入到99 μLPBS中,混匀)

4) 样本浸入PBS漂洗3次,每次5 min。

D、 阳性及阴性对照的准备

TUNEL检测时需设置阳性和阴性对照,以显示实验的客观性及准确性。因此需按照下述方法准备阳性和阴性样本的操作,其余步骤与待测样本同样进行。

1) 阳性对照样本的准备

样本按照前面的实验步骤处理后,加入100 μL的DNase I工作液室温(25-37°C)处理10-30 min,其余步骤均相同。

a)    按照1:10的比例用ddH2O将DNase I Buffer(10 ×)[E-Ck-A334F]稀释成1× DNase I Buffer工作液备用。

b)    滴加100 μL的1× DNase I Buffer工作液到已通透的样本上,室温平衡5 min。

c)    用1× DNase I Buffer工作液按照1:100稀释比将DNase I(100 ×)[E-CK-A334E] 稀释成DNase I工作液。

d)    吸除样本上的多余液体,加入100μL稀释后的DNase I工作液。室温孵育10-30 min。

e)    样本浸入PBS漂洗3次,每次5 min。

注意:

1)DNase I处理固定的细胞会引起染色体断裂,产生许多可标记的DNA 3’末端。故后续实验操作会引起大多数细胞被荧光标记物标记上。

2)每个样本需要准备200μL的1×DNase I Buffer工作液。

3)阳性样本对照载玻片必须使用单独的染色缸,以免玻片上残留的DNase I引起实验组中的假阳性信号。

2) 阴性对照样本的准备

在下述的实验操作过程中标记反应(TdT酶工作液不添加TdT酶,其余步骤均相同。

2. 标记和显色反应

A、 试剂配制

TdT酶工作液配制

参考下表配制适当的TdT酶工作液(根据实际需要配制),充分混匀,现配现用。

1个样品

5个样品

10个样品

ddH2O

34 µl

170 µL

340µl

平衡液(5 ×)

10 µl

50 µl

100 µl

荧光标记液

5 µl

25 µl

50 µl

TdT

1 µl

5 µl

10 µl

TdT酶工作液总体积

50 µl

250 µl

500 µl

B、 标记和显色

1) 按照1:5的比例用ddH2O将平衡液(5×)[E-CK-A334A]稀释成1× 平衡液工作液。每个样本滴加100 μL 1× 平衡液工作液,室温平衡10-30 min。

2) 吸水纸吸除1× 平衡液工作液,每个样本滴加50 μL的TdT酶工作液,加盖玻片于37°C湿盒避光反应60 min(阴性对照样本不加TdT酶)。

3) 样本浸入PBS漂洗3次,每次5 min。

4) 吸水纸吸干水分后,滴加DAPI避光孵育5 min,对标本进行染核。

5) 样本浸入PBS漂洗4次,每次5 min。用吸水纸吸干多余的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。

6) 荧光显微镜下观察,可选用的激发波长范围为450-500 nm,发射波长为515-565 nm(绿色荧光)。


五、常见问题原因及推荐解决方案

现象

可能原因

建议

非特异性染色

TdT酶的浓度过高

TdT dilution buffer* 12110稀释

TdT酶反应时间过长或TdT酶反应过程中反应液渗漏,细胞或组织表面不能保持湿润。

注意控制反应时间,并确保TdT酶反应液能很好地覆盖样品。

光照紫外线导致包埋试剂的聚合(如:甲基丙烯酸会导致样本DNA的断裂)

尝试改用其它包埋材料或其它聚合试剂

在固定组织时样本DNA已断裂(内源核酸酶的作用)

确保样品取样后立即固定或通过肝静脉灌注固定

使用了不适当的固定液,例如一些酸性固定液

采用推荐的固定液

固定后某些核酸酶活性依然较高导致DNA断裂

用含有dUTP dAPT的溶液封闭

标记率低

如果以乙醇或甲醇固定的样本则标记效率较低(因为在固定时染色质未能与蛋白质交联,而在操作中丢失)

用溶于PBS PH7.4中的4%多聚甲醛固定

或福尔马林或戊二醛固定。

固定时间过长,导致交联程度过高

减少固定时间,或用溶于PBS PH7.42%多聚甲醛固定

荧光淬灭

Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭,需注意避光操作

促渗条件不佳,以致于试剂不能到达靶分子或浓度过低

1、 增加通透剂促渗时间

2、增加通透剂的作用温度(15-25℃)

3、优化蛋白酶K的作用浓度和作用时间(如:以400ug/ml作用5min

40.1M的柠檬酸钠70℃作用30min

荧光背景很高

支原体污染

请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染

TdT酶的浓度过高或反应时间过长

TdT dilution buffer* 12110稀释或注意控制反应时间

红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。

高速分裂和增殖的细胞,有时也会出现细胞核中的DNA断裂。

宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。

阳性对照没有信号

DNase I的浓度过低

1、 冷冻切片使用3u/mlDNase I

2、 石蜡切片使用 1500u/mlDNase I

3、 一般样本使用10u/ml DNase I

组织样本从载玻片脱落

组织样本被酶从玻片消化下来

降低蛋白酶K的处理时间