线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的标志性事件，发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋亡便不可逆转。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位∆Ψm的理想荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。JC-1有单体和多聚体两种存在状态，两者发射光谱不同。在正常细胞内，线粒体膜电位较高，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可产生红色荧光；凋亡早期，线粒体膜电位降低，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，可产生绿色荧光。

通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变可检测到细胞膜电位的下降，可将JC-1荧光颜色的转变作为细胞凋亡早期的检测指标。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

JC-1单体的最大激发波长为514 nm，最大发射波长为529 nm；JC-1聚合物的最大激发波长为585 nm，最大发射波长为590 nm。在流式图上表现为FL1和FL2双阳性，而凋亡细胞则大多为FL1单阳性。

二、线粒体膜电位检测实验操作指南

1．根据实验需求配制1× JC-1 Assay Buffer 和JC-1染色工作液，详见产品使用说明。稀释好的1× JC- 1 Assay Buffer保存在4°C。

2．阳性对照设置，详见产品使用说明；细胞按照实验方案进行凋亡诱导。

3．诱导完成后的细胞，300 g离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS轻轻重悬细胞并计数。

注：良好的细胞状态是实验的关键。贴壁生长的细胞用于凋亡检测时，可能会因为胰酶消化、吹打等处理导致细胞的坏死或凋亡，对实验结果可能存在不可控的影响，请谨慎处理。

4．取1-5 × 10⁵重悬的细胞，300 g离心5 min，弃上清。用PBS洗涤细胞一次，离心后弃上清。

5．细胞悬液中加入500 μL JC-1染色工作液重悬细胞。37°C，5%CO₂培养箱中孵育15-20 min。

注：培养温度与细胞类型有关，一般哺乳动物细胞建议37°C，其他种属根据细胞培养条件选择合适的温度。

6．300 g离心5 min，弃上清，加入500 μL预冷的1x JC-1 Assay Buffer洗涤2次。

7．加入500 μL预冷的1x JC-1 Assay Buffer重悬细胞。

8．样本置于冰上保存，30 min内用流式细胞仪检测。

三、显微镜或流式细胞仪检测

A、荧光显微镜观察

1．滴一滴上述细胞悬液于载玻片，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察；

2．对于贴壁细胞来说，也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡；用PBS洗涤细胞两次；

      检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。

出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

B、流式细胞仪分析

用流式细胞仪检测（Ex=488 nm; Em=530 nm）细胞凋亡的情况。

绿色荧光通过FITC通道通常为FL1来检测；红色荧光通过PI通道通常为FL2来检测。

正常细胞{FL-1亮,FL-2亮; R1}，凋亡细胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2}，设门的位置根椐细胞种类、实验条件等不同而变化。

实验需设未经处理的正常细胞为阴性对照组和经CCCP处理的阳性对照组，根椐阴性和阳性对照组的双参数散点图来设定门的位置。