很多人在做细胞周期检测实验的时候，往往需要摸索较长时间条件才能得到稳定可靠的结果，这其中涉及到的因素比较多，为方便大家稳定可靠地获得理想数据，今天为大家详细介绍一下细胞周期检测实验的原理、流程以及注意事项。

细胞周期是指细胞从一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。如下图：

G0期：这一期的细胞称为休眠细胞，细胞暂时脱离分裂周期,不进行DNA复制和分裂。但这些细胞可在某些条件的诱导下可重新开始DNA合成, 进行细胞分裂。

G1 期：主要合成RNA、核糖体、蛋白质、脂类和碳水化合物。

S期：这个时期主要合成DNA, 同时还会合成组蛋白, DNA复制所需的酶都在这一时期合成。

G2期：DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白质, 包括微丝微管蛋白。

M期：RNA合成停止, 蛋白质合成减少, 染色体高度螺旋化。

细胞周期检测的原理：

PI法是经典的周期检测方法，PI是碘化丙啶(Propidium)，一种双链DNA的荧光染料，碘化丙啶和双链DNA结合后可产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可进行细胞周期和细胞凋亡分析。

通常正常细胞的G0/ G1 期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于2N和4N之间。细胞用冰乙醇固定通透后，PI可以与细胞的DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。

因此，可以通过流式细胞内DNA含量进行检测，将细胞周期区分为G1/G0 期，S 期和G2/M 期,并可得出各个时期细胞百分数。

▶细胞周期检测实验流程：

收集细胞：A: 收集细胞5~20×10⁵于离心管中，若细胞比较小(如淋巴细胞)400 g离心，若细胞比较大(如肿瘤细胞)300 g离心，5~10 min，弃去培养液;

洗涤：加入1 ml冷PBS(提前放4℃预冷)洗涤1次，离心弃去上清;

固定前处理：利用管底残留的液体，轻弹管底，将沉淀重悬成细胞悬液，避免细胞成团;

细胞固定：加入约1 ml -20℃预冷的无水乙醇中，轻轻吹打混匀，-20℃固定1 h或过夜;

洗涤：加入1 ml冷PBS(提前放4℃预冷)洗涤1次，300 g离心10min，弃去上清;

RNA酶消化：300 g 离心 5 min，吸尽上清后，加入 100 μL 的 RNase A 并充分悬浮细胞，37°C 水浴 30 min。

PI染色：加入400μL的PI溶液并充分混匀，4℃避光孵育30 min;

上机检测：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，低速获取细胞，采用分析软件进行DNA含量分析。

▶细胞周期检测注意事项：

1、培养细胞注意无菌环境。

2、染液等物质有一定毒性，注意防护。

3、本实验上机检测所需收集细胞量较多，收集细胞时尽量多收集一些。

4、本实验对细胞离心，重悬次数较多，注意动作轻缓，避免过多地损伤细胞。

5、固定时必须预冷PBS重悬打入无水乙醇中，二者顺序不可颠倒。

6、培养细胞时，以对数期处理为宜，避免细胞量过少导致收集细胞量不足或者细胞量过多导致细胞开始大量死亡造成的实验误差。

7、固定后细胞虽然可以保存较长时间后再上机检测，为避免不可控因素影响最好及早上机检测。

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实验图展示：

图：检测经70%乙醇固定过夜后的Molt-4细胞周期效果

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