免疫组化(IHC)

Elabscience®即用型抗体(免疫组织化学)使用方法 (Dako Autostainer Link 48)

2019-12-03作者:admin赞:1


一、目的:

本方法可指导使用者在Autostainer Link 48 (Dako)正确使用Elabscience®的抗体试剂(免疫组织化学)进行免疫组织化学操作,并获得最优结果。

二、范围:

本方法适用于使用Elabscience®的抗体试剂(免疫组织化学)作为一抗在Autostainer Link 48 (Dako)仪器上进行的全自动免疫组化染色实验。

三、程序:

1.试剂与耗材

1.1环保透明脱蜡液;

1.2无水乙醇;

1.3 95% 乙醇;

1.4 PBS磷酸盐缓冲液;

1.5 Tween-20;

1.6免疫组化油笔;

1.7 EnVision™ TMFLEX+,High pH (Link) 货号:K800221-2CN,Dako;

1.8 DAB Away 货号:S196730-2,Dako;

1.9 User Fillable Reagent Bottle,12 mL Capacity,(Link) 货号:SK20110- 2,Dako;

1.10 User Fillable Reagent Bottle,5 mL Capacity,(Link) 货号:SK20005-2,Dako;

1.11 Large Flap Slide Label Kit (875×950)标签纸 货号:S341730,Dako;

1.12苏木素染色液;

1.13中性树胶。

2.仪器设备

2.1烘箱;

2.2 PT Link: PT200, Dako;

2.3全自动免疫组化染色系统:Autostainer Link 48,Dako。



3.实验操作

3.1.烤片:

3.1.1选择需检验的组织切片类型和数量,在切片上进行相应标记;

3.1.2将切片插入染色架中放入烘箱(温度设定62°C)加热烤片1 h;

3.2.脱蜡水化:

3.2.1环保透明脱蜡液中浸泡15 min/次,共2次;

3.2.2无水乙醇中浸泡5 min/次,共2次;

3.2.3 95%乙醇中浸泡5 min/次,共2次;

3.2.4 75%乙醇中浸泡5 min/次,共2次;

注:每次换缸时均需沥干(约5 s),再放入下一缸。

3.2.5取出染色架沥干,自来水震荡冲洗约10 s/次,至少3次。

3.3.抗原修复:

3.3.1根据说明书推荐的抗原修复要求,选择EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution High pH(50×),在 PT Link 进行抗原修复。

PT Link修复方法如下:

3.3.2取适量抗原修复液于修复槽中,提前预热至75°C;

3.3.3立即将放有切片的染色架放入修复槽的修复液中,盖上盖子,继续加热至97°C,修复30 min;

3.3.4修复结束后,待抗原修复液冷却至75°C,打开仪器盖子,取出染色架,放入Wash Buffer中冷却;

3.3.5玻片冷却后,轻甩染色架去掉切片上部分液体,将染色架放在吸水纸上,在离组织2~3 mm处用免疫组化油笔画圈,之后将玻片放入Autostainer Link 48的玻片架上,进行后续的染色步骤。

3.4. Autostainer Link 48染色程序选择FLEX程序,主要参数如下:

3.4.1 FLEX Peroxidase Block (SM801),Volume (µl):100,Incubation: 5 min;

3.4.2 Elabscience®—抗,Volume (µl):100,Incubation: 30 min;

3.4.3 FLEX /HRP (SM802),Volume (µl):100,Incubation: 30 min;

3.4.4 FLEX DAB+ Sub-Chromo(SM803),Volume (µl):200,Incubation: 10 min。

3.4.5其他染色步骤参数参照FLEX程序;

3.4.6附例:Elabscience®—抗,p40(Cat: PA6665)染色程序如下表:

Code

Reagent name

Volume(µL)

Incubation

Buffer

0

SM801

FLEX Peroxidase Block

100

5

Buffer

0

RUO-p40

100

30

Buffer

0

SM802

FLEX/HRP

100

30

Buffer

0

Buffer

5

SM803

FLEX DAB+ Sub-Chromo

200

10

Buffer

0

DI Water

0


Slide log

11/19/2019 11:53:51 AM

Staining started

11/19/2019 11:53:51 AM

Run ID:11

11/19/2019 11:54:28 AM

Rinsed with buffer

11/19/2019 11:58:07 AM

Blowandapply 100 µL EnVision™ FLEX Peroxidase-Blocking Reagent.

11/19/2019 12:03:10 PM

Rinsed with buffer

11/19/2019 12:16:04 PM

Blow and apply 100 µL RUO-p40

11/19/2019 12:46:04 PM

Rinsed with buffer

11/19/2019 12:54:37 PM

Blow and apply 100 µL EnVision™ FLEX/HRP

11/19/2019 1:24:39 PM

Rinsed with buffer

11/19/2019 1:29:49 PM

Rinsed with buffer

11/19/2019 1:37:50 PM

Blow and apply 200uL Substrate Working Solution (mix)

11/19/2019 1:47:56 PM

Rinsed with buffer

11/19/2019 1:58:27 PM

Rinsed with water

11/19/2019 1:58:27 PM

Staining completed

3.5.苏木素复染:

3.5.1 Autostainer Link 48染色结束后,从玻片架上取出玻片,放入染色架上,自来水再冲洗2~3次,轻甩染色架去掉水分,将其放入苏木素染色液中,染色7 min;

3.5.2取出切片沥干(约5 s),自来水震荡冲洗,除去多余的染料,将切片放入PBST中返蓝60 s,之后自来水冲洗3次,轻甩染色架去掉水分。

3.6.脱水透明:

3.6.1 75%的乙醇中浸泡脱水30 s/次,共2次;

3.6.2 95%的乙醇中浸泡脱水30 s/次,共2次;

3.6.3无水乙醇中浸泡脱水30 s/次,共2次;

3.6.4环保透明脱蜡液中浸泡透明5 min。

注:每次换缸时都需沥干(约5 s),再放入下一缸。

3.7.封片:

3.7.1取出切片沥干(约5 s),用吹风机冷风吹干切片;

3.7.2滴加1〜2滴中性树胶于切片组织上(视切片组织数量和大小而定),盖上盖玻片;

3.7.3检查切片,确保切片组织完全被中性树胶覆盖住,且组织中没有较大气泡(若有较大气泡,通过挤压盖玻片排出);

3.7.4将切片放置于通风橱中晾干。

4.镜下观察切片,判定结果。

四、注意事项:

1.本方法适用于使用Elabscience®抗体试剂(免疫组织化学)在全自动免疫组化染色系统Autostainer Link 48上进行免疫组化染色操作使用,由于不同品种/靶标的Elabscience®抗体所要求的抗原修复方式可能存在不同程度的差异,使用者需在使用前仔细阅读说明书并严格按照说明书指导进行使用。

2.本方法对免疫组化实验过程中的重要相关试剂作了品种/型号/厂家的推荐,使用者如需更换相应试剂/原料,需对替代品种进行等效性的评价并寻求最优的操作程序。

3.本方法适用于使用Elabscience®抗体试剂(免疫组织化学)在全自动免疫组化染色系统Autostainer Link 48上进行免疫组化染色操作使用,如使用者更换免疫组化染色系统,需要对替代系统进行等效性的评价并寻求最优的操作程序。