一、目的：

本方法可指导使用者在BOND™ MAX (Leica)正确使用Elabscience^®的抗体试剂(免疫组织化学)进行免疫组织化学操作，并获得最优结果。

二、范围：

本方法适用于使用Elabscience^®的抗体试剂(免疫组织化学)作为一抗在BOND™ MAX (Leica)仪器上进行的全自动免疫组化染色实验。

三、程序：

1.试剂与耗材

1.1环保透明脱蜡液；

1.2无水乙醇；

1.3 95% 乙醇；

1.4 PBS磷酸盐缓冲液；

1.5 Tween-20；

1.6免疫组化油笔；

1.7 Bond™ Dewax Solution 货号：AR9222，Leica；

1.8  Bond™ Wash Solution 10x concentrate 货号：AR9590，Leica；

1.9 Bond™ Epitope Retrieval Solution 1 货号：AR9961，Leica；

1.10 Bond™ Epitope Retrieval Solution 2 货号：AR9640，Leica；

(请根据Elabscience^®—抗使用说明书，在上述两种抗原修复液中选择一种按说明书推荐方法进行抗原修复)

1.11 Bond™ Polymer Refine Detection 货号：DS9800，Leica；

1.12 Bond™ Titration kit: (The Bond Titration Kit contains Bond Titration Container Inserts and Bond Titration Containers)，货号：OPT9049，Leica；

1.13 Bond™ Aspirating Probe Cleaning 货号：CS9100，Leica；

1.14 Bond™ Printer Ribbon & Labels Cxi (6Pack) 货号：S21.4610.A，Leica；

1.15 Bond™ Universal Covertiles 货号：S21.2001，Leica；

1.16中性树胶。

2.仪器设备

2.1 全自动IHC和ISH染色系统：BOND™ MAX，Leica。

3.实验操作

选择需检验的组织切片和试剂类型和数量，通过软件进行“试剂设置”步骤、“玻片设置”步骤、“程序设置”步骤等相关设置，确定染色运行程序，打印标签，对应的组织切片上贴好标签，将贴好标签的玻片和试剂放入染色机中进行质检，质检通过后，进入染色程序，如下：

3.1. Bake and Dewax Protocol：

3.1.1玻片加热至60°C，烤片30 min；

3.1.2玻片温度升至72°C，加入150 µL Bond Dewax Solution，孵育30 s 后除去 Bond Dewax Solution；

3.1.3玻片温度维持在72°C，再加入150 µL Bond Dewax Solution洗涤一次，除去Bond Dewax Solution；

3.1.4玻片温度降至室温，加入150 µL Bond Dewax Solution洗涤一次，除去 Bond Dewax Solution；

3.1.5室温下，加入150 µL酒精冲洗并除去酒精，共洗涤3次；

3.1.6室温下，加入150 µL Bond Wash Solution 冲洗并除去Bond Wash Solution，共洗涤2次；

3.1.7室温下，加入150 µL Bond Wash Solution，孵育5 min 后除去 Bond Wash Solution。

3.2. HIER 20 min with ER1/ER2 Protocol：

3.2.1室温下，加入150 µL ER1或ER2冲洗玻片一次；

3.2.2室温下，加入150 µL ER1或ER2,玻片加热至100°C，孵育20 min；

3.2.3玻片温度降至室温，继续孵育12 min；

3.2.4玻片加热至35°C，加入150 µL Bond Wash Solution冲洗并除去 Bond Wash Solution，共洗涤3次；

3.2.5玻片温度降至室温，加入150 µL Bond Wash Solution，孵育3 min后除去Bond Wash Solution。

3.3 .IHC Protocol F Protocol：

3.3.1室温下，加入150 µL Peroxide Block,孵育5 min；

3.3.2室温下，加入150 µL Bond Wash Solution冲洗玻片并除去Bond Wash Solution,洗涤3次；

3.3.3室温下，加入150 µL—抗试剂，孵育30 min；

3.3.4室温下，加入150 µL Bond Wash Solution冲洗玻片并除去Bond Wash Solution，洗涤3次；

3.3.5室温下，加入 150 µL Post Primary，孵育8 min后除去Post Primary；

3.3.6室温下，加入150 µL Bond Wash Solution，室温孵育2 min后除去 Bond Wash Solution，重复3次；

3.3.7室温下，加入150 µL Polymer，室温孵育8 min后除去Polymer；

3.3.8 室温下，加入150 µL Bond Wash Solution，室温孵育2 min后除去 Bond Wash Solution，重复2次；

3.3.9 室温下，加入150 µL Deionized Water，洗涤1次，除去 Deionized Water；

3.3.10 室温下，加入150 µL Mixed DAB Refine，室温孵育10 min，吸去Mixed DAB Refine；

3.3.11 室温下，加入150 µL Deionized Water冲洗玻片及除去Deionized Water，重复3次；

3.3.12室温下，加入150 µL Hematoxylin，室温孵育5 min后除去 Hematoxylin；

3.3.13 室温下，加入150 µL Deionized Water冲洗玻片1次；

3.3.14 室温下，加入150 µL Bond Wash Solution冲洗玻片1次；

3.3.15 室温下，再加入150 µL Deionized Water冲洗玻片1次。

3.4.脱水透明：

3.4.1 染色程序结束后，取出玻片，甩去多余的Deionized Water；

3.4.2 75%的乙醇中浸泡脱水30 s/次，共2次；

3.4.3 95%的乙醇中浸泡脱水30 s/次，共2次；

3.4.4 无水乙醇中浸泡脱水30 s/次，共2次；

3.4.5 环保透明脱蜡液中浸泡透明5 min。

注：每次换缸时都需沥干(约5s)，再放入下一缸。

3.5.封片：

3.5.1取出切片沥干(约5s)，用吹风机冷风吹干切片；

3.5.2滴加1〜2滴中性树胶于切片组织上(视切片组织数量和大小而定)，盖上盖玻片；

3.5.3 检查切片，确保切片组织完全被中性树胶覆盖住，且组织中没有较大气泡(若有较大气泡，通过挤压盖玻片排出)；

3.5.4将切片放置于通风橱中晾干。

4.镜下观察切片，判定结果。

四、注意事项：

1.本方法适用于使用Elabscience^®抗体试剂(免疫组织化学)在全自动免疫组化染色系统BOND MAX上进行免疫组化染色操作使用，由于不同品种/靶标的Elabscience^®抗体所要求的抗原修复方式可能存在不同程度的差异，使用者需在使用前仔细阅读说明书并严格按照说明书指导进行使用。

2.本方法对免疫组化实验过程中的重要相关试剂作了品种/型号/厂家的推荐，使用者如需更换相应试剂/原料，需对替代品种进行等效性的评价并寻求最优的操作程序。