一、目的：

本方法可指导使用者在Benchmark XT (Roche)正确使用Elabscience^®的抗体试剂(免疫组织化学)进行免疫组织化学操作，并获得最优结果。

二、范围：

本方法适用于使用Elabscience^®的抗体试剂(免疫组织化学)作为一抗在Benchmark XT (Roche)仪器上进行的全自动免疫组化染色实验。

三、程序：

1.试剂与耗材

1.1环保透明脱蜡液；

1.2脱脂奶粉；

1.3无水乙醇；

1.4 95%乙醇；

1.5 10× EZ PREP SOLUTION 货号：05279771001，Roche；

1.6 Reaction Buffer Concentrate (10×) 货号：05353955001，Roche；

1.7 LCS (Predilute) 货号：05264839001，Roche；

1.8 10× SSC SOLUTION 货号：05353947001，Roche；

1.9 CELL CONDITIONING SOLUTION, CC1 (pH 8.4) 货号：05279801001，Roche；

1.10 UltraView Universal DAB Detection Kit 货号：05269806001，Roche；

1.11 返蓝液：BLUING REAGENT 货号：05266769001，Roche；

1.12 苏木素：HEMATOXYLIN II 货号：05277965001，Roche；

1.13 KIT PACK, EBAR(US/EUROPE) 货号：05248850001，Roche；

1.14 RIBBON, EBARPRINTER 货号：05250889001，Roche；

1.15 中性树胶。

2.仪器设备

2.1全自动免疫组化染色系统：Benchmark XT, Roche。

3.实验操作

3.1.烤片：

3.1.1选择需检验的组织切片类型和数量，在切片上进行相应标记；

3.1.2将切片插入染色架中放入烘箱(温度设定62°C)加热烤片30 min〜60 min。

3.2.标签打印：

3.2.1点击“Barcode Label”编写标签信息并打印标签，在对应的组织切片上贴好标签。

3.3 .10%脱脂奶粉溶液浸泡玻片：

3.3.1在200 ml蒸馏水中加入20 g脱脂奶粉，并搅拌均匀，即10%脱脂奶粉溶液(也可使用全脂奶粉配制10%的溶液)

3.3.2把贴好标签的玻片完全浸入10%脱脂奶粉溶液中浸泡15 min，防止组织脱片；

3.3.3浸泡好的玻片在自来水中进行清洗，需要清洗掉玻片上大部分的10% 脱脂奶粉溶液，玻片上需残留少量的10%脱脂奶粉溶液(不可把玻片上的10%脱脂奶粉溶液完全清洗干净)，等待上机染色。

3.4 . Benchmark XT 染色程序：

3.4.1将玻片置于切片盘上，擦干切片背面和标签上的水分，确保每张切片放稳，均处于切片盘的四个卡扣内。

3.4.2将DAB试剂盒、苏木素、返蓝液等试剂放入试剂架(请确保相应的试剂足够)，并检查加样口是否充满液体。如发现没有充满液体，请挤压试剂瓶，排去空气，让液体充满加样口并形成半月形液面。

3.4.3通过Ventana NexES软件设定Protocol，点击RUN完成运行前确认信息并输入切片数量。点击START RUN，系统首先进行自检，自检完成后，程序开始运行。

3.4.4免疫组化染色程序如下：

3.4.4.1 Paraffin [Selected]；

3.4.4.2 Deparaffinization [Selected]；

3.4.4.3 Cell Conditioning [Selected]；

3.4.4.4 Conditioner #1 [Selected]；

3.4.4.5 Mild CC1 95Deg C and Incubate for 30 min [Selected]；

(抗原修复结束后，仪器会提示抽出载玻片台，加一抗试剂，一抗试剂加完之后，将载玻片台推进仪器，手动按仪器上的提示键，即可进入后续染色程序)；

3.4.4.6 Ab Incubation Temperatures [Selected]；

3.4.4.7 Disable Heat for Ab Inc. [Selected]；

3.4.4.8 Titration [Selected]；

3.4.4.9 Hand Apply (Primary Antibody), and Incubate for 32 min；

3.4.4.10  Counterstain [Selected]；

3.4.4.11  Apply One Drop of [HEMATOXYLIN II] (Counterstain), Apply Coverslip, and Incubate for 12 min；

3.4.4.12  Post Counterstain [Selected]；

3.4.4.13  Apply One Drop of [BLUING REAGENT] (Post Counterstain), Apply Coverslip, and Incubate for 4 min；

3.4.5仪器染色结束后，抽出载玻片台，取出玻片并放入含有洗洁精的自来水中清洗，确保洗净每一张玻片上的油脂，再用流水冲洗玻片，直至洗净，甩干玻片上残留的水，进入后续的处理。

3.5.脱水透明：

3.5.1 75%的乙醇中浸泡脱水30 s/次，共2次；

3.5.2 95%的乙醇中浸泡脱水30 s/次，共2次；

3.5.3无水乙醇中浸泡脱水30 s/次，共2次；

3.5.4环保透明脱蜡液中浸泡透明5 min。

注：每次换缸时都需沥干(约5 s)，再放入下一缸。

3.6.封片：

3.6.1取出切片沥干(约5 s)，用吹风机冷风吹干切片；

3.6.2滴加1〜2滴中性树胶于切片组织上(视切片组织数量和大小而定)，盖上盖玻片；

3.6.3检查切片，确保切片组织完全被中性树胶覆盖住，且组织中没有较大气泡(若有较大气泡，通过挤压盖玻片排出)；

3.6.4将切片放置于通风橱中晾干。

4.镜下观察切片，判定结果。

四、注意事项：

1.本方法适用于使用Elabscience^®抗体试剂(免疫组织化学)在全自动免疫组化染色系统Benchmark XT上进行免疫组化染色操作使用，由于不同品种/靶标的Elabscience^®抗体所要求的抗原修复方式可能存在不同程度的差异，使用者需在使用前仔细阅读说明书并严格按照说明书指导进行使用。

2.本方法对免疫组化实验过程中的重要相关试剂作了品种/型号/厂家的推荐，使用者如需更换相应试剂/原料，需对替代品种进行等效性的评价并寻求最优的操作程序。

3.本方法适用于使用Elabscience^®抗体试剂(免疫组织化学)在全自动免疫组化染色系统Benchmark XT上进行免疫组化染色操作使用，如使用者更换免疫组化染色系统，需要对替代系统进行等效性的评价并寻求最优的操作程序。