免疫印迹（WB）
Western Blot操作视频
本视频为Elabscience®公司蛋白免疫印迹的操作指南，对每一步的反应都做了演示，以便实验者能更好地理解WB实验的过程。
实验步骤：
1. 样品准备
裂解液（RIPA）准备-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原钒酸钠溶液，现配现用。加入PMSF，加入原钒酸钠溶液。
组织样本-----黄豆大小组织剪碎，加入200-300 ul配备好的裂解液，冰上研磨，12000转离心5 min，取上清。
贴壁细胞-----6孔板一个孔长满，加150 ul配备好的裂解液，冰上裂解5-10 min，枪头吹打，吸取裂解好的样本，转入EP管，12000转离心5 min，取上清。
悬浮细胞-----细胞转入离心管，2000转离心5 min，弃上清，加入PBS清洗，2000转离心5 min，弃上清，每20 ul体系细胞加入150 ul裂解液，冰上裂解5-10 min，枪头吹打充分裂解，12000转离心5 min，取上清。
2. 蛋白浓度测定
标准曲线制备
待检样本上样
加入显色剂，室温避光20-30 min
酶标仪测定OD值
计算蛋白上样量（建议每样本上样总蛋白含量为50 μg）
3. 样本变性
每40 μL蛋白，加10 ul的5XSDS 上样缓冲液
沸水浴10 min
-20℃保存
4. SDS-PAGE胶制备
灌入分离胶
无水乙醇压平
分离胶完全聚合后，倒出无水乙醇
双蒸水冲洗
滤纸吸干
加入浓缩胶
插上梳齿
浓缩胶完全聚合后取出梳齿
5. 电泳
胶固定到电泳槽
倒入电泳液
加样，加marker,
电泳----80 V恒压至溴酚蓝到浓缩胶与分离胶交界处，改110 V恒压至溴酚蓝到凝胶底部
6. 电转移（湿转）
取出凝胶
切胶
蒸馏水冲洗
滤纸准备
PVDF膜准备，甲醇浸泡5 s
PVDF膜与滤纸一同浸泡于电转液中
7. 封闭
取出转好的PVDF膜，滤纸吸干电转液
放入封闭器内，加5%的脱脂奶粉或5%的BSA
室温封闭2 h
8. 孵育一抗
取出封闭好的PVDF膜，滤纸吸干封闭液，
加稀释好的一抗,4℃孵育过夜
9. 洗脱
TBST冲洗两分钟，摇床漂洗3次，每次5 min
10. 孵育二抗
取出洗脱好的PVDF膜，滤纸吸干洗脱液
加稀释好的二抗, 室温摇床孵育2 h
11. 洗脱
TBST冲洗两分钟，摇床漂洗3次，每次5 min
12. 曝光
ECL底物1:1配比，现配现用
滤纸吸干PVDF膜
加入ECL底物
曝光
13. 数据分析
Bandscan软件分析条带
实验步骤：
1. 样品准备
裂解液（RIPA）准备-----每100 ul RIPA加入1 ul PMSF和1 ul的原钒酸钠溶液，现配现用。加入PMSF，加入原钒酸钠溶液。
组织样本-----黄豆大小组织剪碎，加入200-300 ul配备好的裂解液，冰上研磨，12000转离心5 min，取上清。
贴壁细胞-----6孔板一个孔长满，加150 ul配备好的裂解液，冰上裂解5-10 min，枪头吹打，吸取裂解好的样本，转入EP管，12000转离心5 min，取上清。
悬浮细胞-----细胞转入离心管，2000转离心5 min，弃上清，加入PBS清洗，2000转离心5 min，弃上清，每20 ul体系细胞加入150 ul裂解液，冰上裂解5-10 min，枪头吹打充分裂解，12000转离心5 min，取上清。
2. 蛋白浓度测定
标准曲线制备
待检样本上样
加入显色剂，室温避光20-30 min
酶标仪测定OD值
计算蛋白上样量（建议每样本上样总蛋白含量为50 μg）
3. 样本变性
每40 μL蛋白，加10 ul的5XSDS 上样缓冲液
沸水浴10 min
-20℃保存
4. SDS-PAGE胶制备
灌入分离胶
无水乙醇压平
分离胶完全聚合后，倒出无水乙醇
双蒸水冲洗
滤纸吸干
加入浓缩胶
插上梳齿
浓缩胶完全聚合后取出梳齿
5. 电泳
胶固定到电泳槽
倒入电泳液
加样，加marker,
电泳----80 V恒压至溴酚蓝到浓缩胶与分离胶交界处，改110 V恒压至溴酚蓝到凝胶底部
6. 电转移（湿转）
取出凝胶
切胶
蒸馏水冲洗
滤纸准备
PVDF膜准备，甲醇浸泡5 s
PVDF膜与滤纸一同浸泡于电转液中
按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好
电转
转膜时间
7. 封闭
取出转好的PVDF膜，滤纸吸干电转液
放入封闭器内，加5%的脱脂奶粉或5%的BSA
室温封闭2 h
8. 孵育一抗
取出封闭好的PVDF膜，滤纸吸干封闭液，
加稀释好的一抗,4℃孵育过夜
9. 洗脱
TBST冲洗两分钟，摇床漂洗3次，每次5 min
10. 孵育二抗
取出洗脱好的PVDF膜，滤纸吸干洗脱液
加稀释好的二抗, 室温摇床孵育2 h
11. 洗脱
TBST冲洗两分钟，摇床漂洗3次，每次5 min
12. 曝光
ECL底物1:1配比，现配现用
滤纸吸干PVDF膜
加入ECL底物
曝光
13. 数据分析
Bandscan软件分析条带
