人外周血PBMC的制备流程

1. 收集抗凝人外周血，用1640无血清培养基或PBS按照1:1的比例稀释，上下颠倒混匀或者用移液枪吹打混匀。

2. 在15 mL离心管中，先加入3 mL 充分混匀的Ficoll液（1.077 g/mL），再沿着管壁缓慢加入2 mL稀释后的血液，血液和Ficoll液分层明显为成功。

注：Ficoll提前半小时从4℃冰箱取出恢复到室温，温度过高会导致分离不明显，温度过低会导致密度过大，同样分离效果不好， 20~25℃最佳。。

3. 将样本小心转移到离心机，500 g离心25 min。

4. 小心取出离心管，吸取中间层的白色薄膜层，即为单个核细胞。

5. 用10 mL PBS洗涤获得的单个核细胞，250 g离心10 min，弃上清。

6. 重复洗涤一次。

7. 用细胞染色缓冲液重悬细胞备用。

人外周血PBMC流式FSC/SSC图

注意事项：

1. Ficoll使用时的温度很重要，温度太高或者太低都会影响分离效果。

2. 血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2 h 以内），为保持细胞活力，应避免冷冻和冷藏。

3. 50 mL离心管离心效率比15 mL离心管差，为了获得最大量的单核细胞，最好用15 mL离心管，且离心管使用量不要超过三分之一，可以将血样进行等分后加入多个离心管。

4. 分选后的细胞样本直接诱导阻断进行细胞因子的检测，效果最佳，分选后的样本也可冻存，需要的时候再诱导检测。

5. 诱导阻断后来不及检测的样本，最好冻存，并在3天内检测效果最好。冻存液推荐使用90%的FBS+10%的DMSO。冻存24 h再检测，结果无大的影响；冻存3天再检测，CD3和IFN-γ表达略有降低；冻存1周后再复苏检测，CD3和IFN-γ表达较大幅度降低。

9. Ficoll分离液分离后图片：