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流式课堂

流式课堂 | 裂红or分离液?外周血不同制备方法应用场景

2022-09-15作者:admin赞:0

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外周血样本采集完毕后,我们需要对其中的待测单细胞进行提取。针对外周血样本,最常使用的样本制备方法有两种:


一. 裂红法

利用红细胞裂解液,去除红细胞


二. Ficoll法

利用不同细胞的沉降系数差异,进行梯度密度离心,提取PBMC


两种方法分别在什么场景下应用?接着往下看。


裂红法

裂红法,即裂解样本中的红细胞。血液中的红细胞比白细胞多10-100倍,红细胞数量过多,会影响细胞群体的分析。因此,我们在做血液样本检测时,经常需要裂解红细胞。

裂红法 裂红法

                              裂红前                                                              裂红后


01 原理

红细胞表面有专属的表面抗原,当裂解液中含有可以攻击特定红细胞表面抗原的酶,就只会造成红细胞的变形、膨胀、裂解。


02 优点

⊙ 各类型白细胞(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等)保存完整

⊙ 得率高

⊙ 步骤简单,10min即可


03 缺点

⊙ 对裂红时间要求较高,过长或过短均会影响结果

⊙ 细胞活性低于Ficoll法


04 使用注意事项

⊙ 裂解时间过长,也会对其它细胞造成损伤,所以要把握好裂解的时间

做流式检测时,并非所有的血液样本都需要裂红。倘若需要检测的是白细胞(如淋巴、单核、粒细胞等),需要裂解红细胞;倘若检测的是红细胞,不需要裂解红细胞;

⊙ 如果后续样本不用于流式分析,而是需要培养或者冻存复苏,使用裂红后培养的细胞,活性可能会打折扣。


目前市面上的红细胞裂解液有两种:含有固定剂;不含有固定剂。


Elabscience®红细胞裂解液产品

货号

名称

规格

可处理样本类型

特点

E-CK-A105

10×ACK Lysis Buffer

100mL

小鼠脾脏;人外周血

不含固定剂

E-CK-A106

10×RBC Lysis/Fixation Solution

100mL

人外周血

含固定剂


不含固定剂的红细胞裂解液作用较为温和;含有固定剂的红细胞裂解液作用较为强烈,但是裂红效果相对更好。


使用含固定剂的红细胞裂解液要注意:

a. 固定剂可能会降低抗体的荧光信号强度,特别是串联染料;

b. 同时,如果在染色前对细胞进行了固定,抗原表位可能会因为固定被破坏,导致抗体无法识别。


Ficoll 密度梯度离心法


01 原理

根据细胞的沉降系数差异,借助细胞分离液和离心操作,对细胞进行分离。

Ficoll 密度梯度离心法原理


02 优点

⊙ 获得的细胞更纯净,有利于细胞培养后检测胞内因子

⊙ 可将细胞冻存后再复苏、培养、检测

⊙ 去除死细胞


03 缺点

⊙ 步骤复杂,需30min以上

⊙ 取白膜层需要丰富的经验

⊙ 只能获得淋巴细胞和单核细胞,会丢失一部分稀有细胞

⊙ 可能会引起细胞受体激活

Ficoll 密度梯度离心法分离前Ficoll 密度梯度离心法分离后

                                分离前                                                               分离后


总 结


如研究对象是淋巴细胞、单核细胞或粒细胞,且细胞不需要进行培养或冻存,仅进行流式分析时,建议使用裂红法制备外周血样本;

如研究对象是淋巴细胞亚群或单核细胞,在做以下实验时,建议使用Ficoll法提取PBMC:

(1)获得的细胞需要继续培养、刺激、阻断或冻存;

(2)研究单核细胞。因为单核细胞只占白细胞的3-10%,如果使用裂红法,会发现细胞群体太少。为了保证充足的样本量,需要使用Ficoll法。


以上就是裂红法和Ficoll法在不同实验场景下的应用。如有其他实验相关问题,欢迎在咨询右侧的在线客服进行咨询



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