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流式课堂 | 粘连体对流式实验结果的影响及排除方法

2022-09-28作者:admin赞:0

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粘连体,是指两个或更多个细胞粘在一起(大多数是两个)的现象。

理想状态下,细胞是一个一个通过流式细胞仪激光照射区的。细胞通过激光照射区所产生的荧光信号被PMT接收,转化成电脉冲信号,如图所示:

理想状态下细胞

从细胞进入激光照射区到离开,电脉冲信号由0到达峰值,再降回0,被记录为一个峰值。H是脉冲高度,代表脉冲信号的峰值,W是脉冲宽度,是指细胞通过激光照射区域的时间,A是脉冲信号的面积。

细胞电脉冲信号

现实情况下,由于各种原因,细胞与细胞会粘在一起,连续通过激光照射区,被仪器认定为一次信号。

当两个细胞挤在一起通过仪器,与单个细胞相比,测量高度不变,宽度和面积变为两倍,即出现FSC-Height不变,FSC-Area和Width增大的现象,如图所示:


细胞粘连现象

分析数据时,如果没有排除粘连体,就可能对结果的判断造成误导。举个例子:

如果样本中一部分细胞带有GFP绿色荧光,一部分细胞不带荧光,需要分选出带有GFP信号的细胞,细胞在缓冲液中的状态,可能会出现以下5种情况:

单细胞

单细胞


粘连体

粘连体

一个带GFP和一个不带GFP的细胞形成的粘连体(红框),在没有被排除的情况下,会被默认为是带GFP的细胞,从而被流式细胞仪收集。这样,我们实际分析带GFP的细胞时,就会掺杂不带GFP的细胞到数据中来,使得带GFP细胞比例高于实际比例。如果是分选带GFP的细胞中,就会被掺入不带GFP的细胞,影响所收集细胞的纯度。

既然粘连体会对结果造成这么大的影响,有哪些方法可以在上机时排除粘连体呢?


01.FSC-A与FSC-H

一般来说,我们会使用FSC-A与FSC-H来排除粘连体。如前所述,正常单细胞通过流式细胞仪激光照射区时,H和A是成正比增大的,而粘连体通过时,H不变,A增大,因此,可通过细胞的FSC-A(Area)与FSC-H(Height)参数完美排除掉粘连体。

FSC-A与FSC-H

02.FSC-H与W

由于双粘连体的脉冲宽度大于单个细胞脉冲的宽度,基本达到两倍的关系,所以我们也可以使用FSC-H与W来排除粘连细胞。因为H独立于W,这种方法不会受到面积的影响,也是非常值得推荐的。需要注意的是,如果检测样本中各种细胞的大小差异较大,此种分析方式可能不太适用。

FSC-H与W

通过以上方法,可以完美排除掉粘连体,避免粘连体造成的假阳性影响。但是,如果粘连体太多,即使在分析数据时排除掉,对实验结果的影响仍然很大,对仪器管路也不利。因此,在前期样本制备时预防粘连体,才是首选之策。



样本制备时,应注意以下几点,以减少粘连体的发生:

PAY ATTENTION

1. 充分消化并吹散混匀;

2. 样本尽量新鲜制备,特别是组织分离制备的单细胞悬液;

3. 上机前用200目筛网过滤;

4. 上机前吹打混匀,勿长时间静置。


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