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流式课堂 | 组织单细胞悬液制备中各种酶的特性及应用场景

2023-02-02作者:admin赞:0

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组织由细胞和细胞外基质(ECM)有序而紧密地联结在一起。从组织中获取单细胞悬液,应用于流式检测、单细胞测序、体外培养、药物筛选、细胞移植、类器官培养以及肿瘤研究等方面,更接近体内的天然状态,具有很多优势。


要想获得高品质的单细胞悬液,需要采取一些有效措施,其中,酶消化法就是一种既能维持细胞的最佳状态、又能有效地获得单个细胞的方法。


消化组织的酶多种多样,常见的消化酶主要有以下几种。根据消化原理的不同,其应用场景也各不相同:


分类

原理

应用

注意事项

胰蛋白酶

作用于赖氨酸或精氨酸结合的肽腱,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而分离细胞

用于消化细胞间质较少的软组织,如胚胎、上皮、肝、肾等组织;不适用于纤维组织和较硬的癌组织

EDTA可以用来增强胰蛋白酶的水解功能,血清会影响胰蛋白酶的活性

胶原酶

胶原酶Ⅰ

水解细胞间质的脯氨酸,分离细胞,仅对细胞间质有消化作用,对细胞的损害小

消化上皮、肺、脂肪、肾上腺上皮细胞

钙镁离子和血清不会对胶原酶的活性及消化作用产生影响

胶原酶Ⅱ

消化肝脏、骨、软骨、肿瘤、甲状腺、心脏、唾液腺组织细胞

胶原酶Ⅲ

可消化所有哺乳动物组织

胶原酶Ⅳ

可消化多种组织

胶原酶Ⅴ

消化胰岛小岛组织

透明质酸酶

通过随机降解透明质酸的β-N-乙酰己糖胺-[1-4]糖苷键,降低透明质酸的活性

常和胶原酶搭配,消化结缔组织

常规情况下较稳定,不会分解

DNaseⅠ

作用于细胞分离降解出的DNA,避免DNA引发的细胞凝集,对细胞完整性无破坏作用

常配合胶原酶或透明质酸酶等联合使用,一般不会单独使用

EDTA等金属离子螯合剂,达到mmol/L浓度的锌离子,0.1%的SDS,DTT、巯基乙醇等还原剂,50-100 mM以上盐浓度均对DNase Ⅰ有显著抑制作用

中性蛋白酶

中性蛋白酶只水解由亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等疏水大分子氨基酸提供氨基的肽键

具有温和的蛋白酶水解活性,不会损坏细胞膜的完整性,常与胶原酶等联合使用,其分离纤维样组织的效率高于上皮组织

大多数微生物的中性蛋白酶是金属酶,热稳定性较差,很易自溶,钙离子可以增加酶的稳定性,并减少酶自溶

弹性蛋白酶

作用于弹性蛋白的肽键、酰胺键和酯键将其水解,可水解天然的弹力素

常与胰蛋白酶和胶原酶等联合使用,用于分离结缔组织和含有大量细胞网状纤维的组织。很适合消化肺脏,分离肺泡Ⅱ型细胞

作用的最适pH值7.8,最适作用温度25℃

木瓜蛋白酶

属巯基蛋白酶,可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端,并能优先水解那些在肽键的N-端具有两个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键

常用来分离皮层神经元、视网膜、平滑肌

最适合的pH值6~7;最适合的温度55~65℃,耐热性强,在90℃时也不会完全失活;受氧化剂抑制、还原性物质激活


由于不同组织的细胞和结构不同,利用单一的酶消化细胞无法达到良好的效果,常常需要几种不同的酶混合搭配,才能获得性能最佳的单细胞悬液。针对具体的组织,仍需试验摸索,以确定最佳消化方案。以下列表方法供大家参考。


表一:人体组织常用的消化方案参考

类别

组织

消化酶

参考文献PMID

人-正常组织

心肌组织

胶原酶Ⅱ(200 IU/mL)

28202059

肝脏

胶原酶D(2.5 mg/mL)

25533785

DNaseⅠ(0.1 mg/mL)

肺实质

胶原酶(300 U/mL)

3026698

DNaseⅠ(50 U/mL)

蛋白酶XIV(2 mg/mL)

7681268

凝乳酶(0.5 mg/mL)

肾脏

胶原酶Ⅰ(0.025%)

31385550

牙髓

胶原酶Ⅰ(2 mg/mL)

24831838

扁桃体

胶原酶(1 mg/mL)

27598832

DNaseⅠ(0.25 mg/mL)

胎盘组织

胶原酶Ⅱ(0.25%)

30122114

胰蛋白酶(0.25%)

胎盘

胰蛋白酶(0.25%)

30541665

DNaseⅠ(200 µg/mL)

人-肿瘤组织

鳞状细胞癌

胰蛋白酶(0.05%)

2452013

EDTA(2 mM)

神经纤维瘤

中性蛋白酶(1.25 U/mL)

1696266

胶原酶Ⅰ(0.05%)

透明质酸酶(0.1%)

胶质瘤

胶原酶Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅺ

(1 mg/mL)

27598832

DNaseⅠ(0.25 mg /mL)

黑色素瘤

胶原酶Ⅳ(1 mg/mL)

23525090

DNaseⅠ(0.1 mg/mL)

肺肿瘤

胶原酶Ⅰ(170 mg/L)

25359999

胶原酶Ⅱ(56 mg/L)

胶原酶Ⅳ(170 mg/L)

DNaseⅠ(0.002%)

弹性蛋白酶(0.002%)

乳腺癌

胶原酶Ⅰ(4 mg/mL)

30692706

透明质酸酶(1 mg/mL)

胰蛋白酶(0.1%)

结肠癌

胰蛋白酶(0.25%)

6830688

EDTA(0.19%)


表二:小鼠组织常用的消化方案参考

类别

组织

消化酶

参考文献PMID

小鼠-正常组织

心脏

胶原酶Ⅳ(0.1%)

17577582

胰蛋白酶(0.2%)

弹性蛋白酶(4 U/mL)

29956144

中性蛋白酶(1 U/mL)

DNaseⅠ(200 μg/mL)

胸腺

胶原酶D(0.125%)

25367128

DNaseⅠ(0.1%)

中性蛋白酶Ⅱ(0.72 mg/mL)

29322413

胶原酶A(1 mg/mL)

小鼠-肿瘤组织

肺癌

中性蛋白酶(50 U/mL)

22064658

胶原酶(400 U/mL)

DNaseⅠ(50 U/mL)

乳腺肿瘤

胶原酶(1.5 mg/mL)

23959163

透明质酸酶(20 μg /mL)


表三:大鼠组织常用的消化方案参考

类别

组织

消化酶

参考文献PMID

大鼠-正常组织

心脏

胶原酶Ⅱ(200 IU/mL)

28202059

肝脏

胶原酶Ⅳ(0.5 mg/mL)

27054325

DNaseⅠ(20 μg/mL)

肾脏

胶原酶(1 mg/mL)

28668953

大鼠-肿瘤组织

结肠癌

胶原酶Ⅰ(1.6 mg/mL)

23193035

透明质酸酶(20 μg /mL)

DNaseⅠ(60 μg/mL)


举个例子

4T1荷瘤小鼠的酶消化过程及染色流程如下所示:

(1)10×混合消化酶的配制:取80 mL HBSS缓冲液, 加入1 g胶原酶 IV,100 mg透明质酸酶,为降低细胞粘稠度和凝集,额外加入20,000 U DNaseⅠ,充分溶解混匀,补加HBSS缓冲液,定容至100 mL,使用0.22 μm的滤膜过滤,分装成5 mL/支,储存于-20℃条件下,使用前恢复至室温;

(2)肿瘤分离:用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死,放置于含有75%酒精的烧杯中,浸泡3~5 min,使用剪刀和镊子剥离肿瘤,PBS洗涤2次;

(3)肿瘤组织的消化:将肿瘤转移至1.5 mL EP管中,手持弯剪,插入EP管反复剪切至大小约为0.5~1 mm3的颗粒,补加1 mL HBSS缓冲液,转移到15 mL离心管,再使用8 mL HBSS缓冲液重悬肿瘤颗粒,加入1 mL 10×混合消化酶,轻轻吹打混匀,在摇床上以80 rpm、37℃的条件消化1~2 h;

★注:10 mL消化液可充分消化体积约为1 cm3的肿瘤组织。

(4)单细胞悬液的制备:每30 min使用1 mL移液器吹吸组织块1次,至吹吸无明显阻碍视为消化彻底, 用100 μm筛网过滤除去杂质,并使用大体积约50 mL的HBSS缓冲液洗涤一次,300 g离心5 min,弃上清,补加适当体积的HBSS缓冲液或PBS缓冲液重悬细胞沉淀,即为肿瘤单细胞悬液;

(5)流式染色:细胞计数,调整细胞到合适的密度(1*107/mL),并进行流式染色和分析。


流式染色


图1:混合酶消化后的4T1肿瘤细胞,使用PerCP/Cyanine5.5 Anti-Mouse CD45 Antibody[30-F11](Cat.:E-AB-F1136J),FITC Anti- Mouse CD3 Antibody [17A2](Cat.:E-AB-F1013C),PE Anti-Mouse CD4 Antibody [GK1.5](Cat.:E-AB-F1097D),APC Anti-Mouse CD8a Antibody [53-6.7](Cat.:E-AB-F1104E)进行标记染色并分析。


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