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酶联免疫吸附实验(ELISA)

ELISA实验前,你需要了解的细胞培养&样本收集处理

2023-02-08作者:admin赞:0

细胞培养 Cell Culture


细胞培养是指细胞在体外的培养技术,即在无菌条件下,从机体中取出组织或细胞,模拟机体内正常生理状态下的基本生存条件,让它在培养皿中继续生存、生长和繁殖的方法。通过细胞培养,我们可以获得大量性状相同的细胞,以便研究细胞的形态结构、化学组成、功能及机制。在生物实验中,细胞培养周期往往比哺乳动物短,因此,细胞培养是一种更为便捷的体外验证方法。


本文带大家了解一下哺乳动物的细胞培养过程,及ELISA实验中细胞样本的收集与处理方法


有关细胞传代,可以参考推文《细胞培养『三板斧』,您抡的还顺手吗?》(点击查看推文)

有关细胞的冻存与复苏,可以参考推文《细胞学堂 | 细胞冻存与复苏的正确姿势》(点击查看推文)


Part. 1


/// 培养基 ///

一般细胞都可以在培养瓶中使用液体培养基培养,但是,某些细胞需要在胶原蛋白等特殊基质上培养,以促进细胞附着、分化或生长,建议查阅相关文献,或咨询细胞类产品的技术支持,以获得您正在培养的细胞的进一步信息。


常用的液体培养基可分为基础培养基和完全培养基:


基础培养基(无血清培养基):在平衡盐溶液中添加氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。


完全培养基:由基础培养基和添加剂(如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子)组成。

#胎牛血清 Fetal Bovine Serum

胎牛血清是完全培养基最常用的添加成分。虽然胎牛血清中含有很多支持细胞生长的活性物质,但同时也给细胞培养及分泌物检测造成了诸多不利。例如,检测细胞上清中的TGF-β1含量时,胎牛血清中含有的高浓度潜隐TGF-β1,会对结果造成干扰。为了获得有效的实验结果,需要设立适当的对照,确定TGF-β1的基准浓度。


小贴士

培养基中添加酚红,便于实时监测pH值。随着孵育时间的增加,pH值范围8→6,培养基会由红色变为黄色。

培养基颜色变化

Part. 2


/// 毒性实验 ///

细胞体外实验通常先进行细胞毒性实验,通过检测药物本身对细胞存活率的影响,来初步摸索药物浓度使用情况。最常用的细胞毒性测试方法是CCK-8法,想了解CCK-8法更多细节的小伙伴,可参考推文《流式课堂 | 数据对不上?细胞周期&CCK-8结果关联性分析》(点击查看推文)流式课堂 | 数据还是对不上?Annexin V&CCK-8结果关联性分析》(点击查看推文)哦!


以下图为例,不同材料对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞的增殖影响不一:

Relative growth rate of MC3T3-E1 on the substrate and MAO coated samples

Fig 2. Relative growth rate of MC3T3-E1 on the substrate and MAO coated samples[1]


注意 Pay Attention

毒性药物在浓度过高的情况下,会破坏细胞渗透压平衡,从而导致细胞死亡,并非药物本身的作用。因此,在浓度选取上需格外谨慎。


Part. 3


/// 刺激与干预 ///

在体外对细胞进行刺激和干预,会发生多种生理反应,造成大量信号通路及蛋白质水平的变化。细胞实验中,这一步十分关键,因为生物学实验本身的重复性较差,建议结合实验室现有条件,摸索其中变量的改变。

文献中常用的变量有药物(毒物)、营养、酸碱度、氧含量、渗透压、光照、放射、应力、机械损伤、电磁、温度、基因敲除与转染、细菌、病毒等等。


Part. 4


/// 样本收集处理 ///


细胞上清

需保证各组间培养细胞的数量基本一致,细胞生长状态良好。建议采用6孔板培养细胞,并保证细胞数量达到106左右,即细胞密度达70%-80%左右,即可收集培养液,于2-8℃、1000×g离心20分钟,除去杂质及细胞碎片,取上清检测。


细胞裂解液

贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗,然后用胰蛋白酶消化,1000×g离心5分钟后收集细胞;悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每106个细胞中加入150-200μL PBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂;若含量很低,可减少PBS的体积),并通过反复冻融或超声,使细胞破碎。将提取液于2-8℃、1500×g离心10分钟,取上清检测。


反复冻融:-80℃放置1h/液氮放置0.5h,然后置于30℃水浴锅中,轻微振荡,使其迅速融化,此操作反复2-3次即可。

超声方法:用超声波发生器,以振幅14μm超声处理30 s,在冰水浴条件下,破碎细胞;或者使用超声波破碎仪,200 W,2 s/次,间隙3 s,总时间5 min。

样本中建议提前加入蛋白酶抑制剂,常规推荐PMSF:工作浓度:17~174μg/mL(0.1~1mM)。


细胞培养过程中,有许多条件需要摸索,包括细胞类型、培养基组分、细胞数量、生产状态、干预条件和物质等。前期基础打得牢固,对后续ELISA或其他种类实验的开展,及结果的分析,具有更多的参考意义。


参考文献

[1] Chen Y, Dou J, Pang Z, et al. Ag-containing antibacterial self-healing micro-arc oxidation coatings on Mg–Zn–Sr alloys[J]. Surface Engineering, 2021, 37(7): 926-941.

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