产品快报
Co-IP实验中轻重链干扰的解决方法
内容预告:本文将和大家一起探讨IP(免疫沉淀)实验中的轻重链干扰问题,分析如何减少这种干扰。
大家知道,免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质A的抗体免疫沉淀A,那么与A在体内结合的蛋白质B也能沉淀下来。
目前多用精制的Protein A/G预先结合固化在凝胶磁珠(Agarose Beads)上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应,磁珠(Beads)上的Protein A/G就能吸附抗原,达到捕获目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合,也可用于确定特定蛋白质新的作用搭档。
IP实验过程一般分为3个阶段
① 制备组织或细胞裂解液;
② 加入捕获抗体、Protein A(G)凝胶/磁珠,形成并纯化免疫复合物(IP complex);
③ WB检测,SDS-PAGE分离免疫复合物,转膜,与特异性检测抗体孵育,加入酶标二抗,曝光显影。
要想减少IgG重链轻链对实验结果判断的干扰,首先要理解这些干扰是如何产生的:
Fig 1. IP复合物(IP Complex)的结构
由图1可以看出,免疫沉淀复合物由三部分组成:ProteinA(G)凝胶、抗体IgG分子、目标蛋白。SDS-PAGE后,这些成分都会一起转移到膜上。当检测抗体与捕获抗体物种来源相同的时候,二抗会识别捕获抗体的重链轻链分子,导致出现55kDa重链带、20~25kDa轻链带的干扰。
那么,如何避免这些杂信号的影响呢?
常见的方法有:
(1)捕获抗体、检测抗体采用不同来源物种,使用针对检测抗体物种的特异性二抗;
(2)有条件的话,捕获抗体采用没有恒定区的纳米抗体。
受限于经费预算与市场供应,上面两个解决方案都不是那么容易实现的。不过,如果您准备做标签蛋白的IP实验,Elabscience®为您提供的解决方案,可以完美避开重链轻链杂信号的干扰。
01 如果您做的是FLAG、HA、MYC标签蛋白,建议选用Elabscience®快速免疫沉淀试剂盒系列产品。
这个系列的试剂盒包括四种成分:针对标签的小鼠单抗偶联的亲和凝胶,针对标签的特异性兔多抗,针对兔IgG的、吸附过的特异性二抗,还有一支Mouse IgG 亲和凝胶作对照。试剂盒操作快速,简便,完全避开了重轻链等杂信号干扰。
关键是价格很实惠,一只普通一抗的价格,就可以搞定一个试剂盒。
02 如果您做的是GFP标签蛋白或者mCherry标签蛋白,建议选用Elabscience®GFP纳米抗体磁珠凝胶产品、mCherry磁珠凝胶产品。
实验效果图如下:
03 Elabscience®也可以单独为您提供经过特异性吸附的二抗:
产品名称 |
货号 |
应用 |
|
Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(peroxidase/HRP conjugated) |
E-AB-1001 |
WB,IHC,ELISA |
|
Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(peroxidase/HRP conjugated) |
E-AB-1003 |
WB,IHC,ELISA |
经过非特异性吸附后的二抗,不会交叉识别其他物种抗体的重链和轻链,特异性好,当用特异性一抗进行IP实验时,也是非常好的二抗产品。
Elabscience®推出的标签抗体快速沉淀试剂盒套装,可进行50次IP实验,且无需额外购买一抗、二抗、IgG对照试剂。有了它,标签相关IP/Co-IP实验再也不用担心了!活动细节,请详询当地授权代理商。
套装组成(以FLAG标签快速免疫沉淀套装为例)
产品名称 |
货号 |
成分(规格) |
保存条件 |
Anti-FLAG(DYKDDDDK) 亲和凝胶 |
EA-IP-001 |
共价偶联Anti-FLAG小鼠单抗的琼脂凝胶,2mL(0.5mL/mL) |
-20℃,12个月 |
Mouse IgG亲和凝胶 |
EA-IP-100 |
共价偶联Mouse IgG的琼脂糖凝胶,2mL(0.5mL/mL) |
-20℃,12个月 |
Flag-Tag Polyclonal Antibody一抗(宿主:Rabbit) |
E-AB-40525 |
100μg (1mg/mL) |
-20℃,12个月 |
Goat Anti-Rabbit IgG(peroxidase/HRP conjugated)二抗 |
E-AB-1003 |
100μg (1mg/mL) |
-20℃,12个月 |
主要产品列表
产品名称 |
货号 |
规格 |
价格 |
Anti-FLAG标签(DYKDDDDK)快速免疫沉淀套装 |
EA-IP-K001 |
50 Tests |
4380元 |
Anti-HA标签(YPYDVPDYA)快速免疫沉淀 套装 |
EA-IP-K002 |
50 Tests |
4380元 |
Anti-MYC标签(EQKLISEEDL)快速免疫沉淀套装 |
EA-IP-K003 |
50 Tests |
4380元 |
以上,是分享的Co-IP实验轻重链干扰解决之道,希望对大家的实验有帮助~