问题

可能原因

解决方法

背景值高

膜没有均匀浸润

PVDF 膜转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿，转膜前用缓冲液浸泡10min

膜或者缓冲液污染

拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液

封闭不充分

更换封闭液或延长封闭时间

抗体与封闭液出现交叉反应

检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应

抗体浓度过高

做预实验检测确定一抗、二抗的最佳工作浓度

杂带多

一抗不是唯一特异的

制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点制备抗体

二抗出现非特异性结合

设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合

不同的剪接体

选取抗原特异区域进行免疫

无信号或信号弱

抗体不适合于WB

设置阳性对照和内参蛋白

抗体浓度太低

加大抗体浓度

抗体保存不当

分装保存，避免反复冻融

抗原不充足

增加蛋白上样量

膜漂洗过度

减少漂洗的时间和次数

转膜不充分

延长转膜时间或增大转膜电压