免疫荧光(IF)

免疫荧光常见问题分析

2017-09-01作者:admin赞:100Protocol下载

问题

原因

建议

背景过高

一抗质量不高

使用特异性高、效价高的一抗

一抗/二抗浓度太高

降低一抗/二抗浓度

封闭不完全 

增加蛋白封闭时间

洗涤不充分

增加冲洗次数与时间

可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景

 

信号弱或无信号

无目的蛋白或表达量极少

选用表达量高的细胞或组织

细胞通透性差

增加通透剂的作用时间或浓度

一抗/二抗浓度太低

增大其浓度

二抗选择错误(种属不匹配)

选用与一抗种属相匹配的二抗

荧光猝灭快

荧光素本身特性决定,光稳定性差

选用光稳定性好的荧光素二抗

用普通的封片剂封片

选用防荧光猝灭剂封片

细胞有自发荧光

使用了戊二醛固定

在固定后荧光染色前进行荧光淬灭,如使用NaIO4NaBH4,甘氨酸等,染色前检查自发荧光

材料本身(如石蜡)有自发荧光

设立阴性对照,通过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色

细胞成分中能够产生自发荧光的分子(例如核黄素、细胞色素等)的含量高;培养细胞中死细胞/活细胞比例高

 

问题

原因

建议

背景过高

一抗质量不高

使用特异性高、效价高的一抗

一抗/二抗浓度太高

降低一抗/二抗浓度

封闭不完全 

增加蛋白封闭时间

洗涤不充分

增加冲洗次数与时间

可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景

 

信号弱或无信号

无目的蛋白或表达量极少

选用表达量高的细胞或组织

细胞通透性差

增加通透剂的作用时间或浓度

一抗/二抗浓度太低

增大其浓度

二抗选择错误(种属不匹配)

选用与一抗种属相匹配的二抗

荧光猝灭快

荧光素本身特性决定,光稳定性差

选用光稳定性好的荧光素二抗

用普通的封片剂封片

选用防荧光猝灭剂封片

细胞有自发荧光

使用了戊二醛固定

在固定后荧光染色前进行荧光淬灭,如使用NaIO4NaBH4,甘氨酸等,染色前检查自发荧光

材料本身(如石蜡)有自发荧光

设立阴性对照,通过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色

细胞成分中能够产生自发荧光的分子(例如核黄素、细胞色素等)的含量高;培养细胞中死细胞/活细胞比例高

 

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