免疫荧光（IF）
免疫荧光常见问题分析
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问题 |
原因 |
建议 |
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背景过高 |
一抗质量不高 |
使用特异性高、效价高的一抗 |
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一抗/二抗浓度太高 |
降低一抗/二抗浓度 |
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封闭不完全 |
增加蛋白封闭时间 |
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洗涤不充分 |
增加冲洗次数与时间 |
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可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景 |
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信号弱或无信号 |
无目的蛋白或表达量极少 |
选用表达量高的细胞或组织 |
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细胞通透性差 |
增加通透剂的作用时间或浓度 |
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一抗/二抗浓度太低 |
增大其浓度 |
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二抗选择错误（种属不匹配） |
选用与一抗种属相匹配的二抗 |
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荧光猝灭快 |
荧光素本身特性决定，光稳定性差 |
选用光稳定性好的荧光素二抗 |
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用普通的封片剂封片 |
选用防荧光猝灭剂封片 |
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细胞有自发荧光 |
使用了戊二醛固定 |
在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 |
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材料本身（如石蜡）有自发荧光 |
设立阴性对照，通过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色 |
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细胞成分中能够产生自发荧光的分子（例如核黄素、细胞色素等）的含量高；培养细胞中死细胞／活细胞比例高 |
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问题 |
原因 |
建议 |
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背景过高 |
一抗质量不高 |
使用特异性高、效价高的一抗 |
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一抗/二抗浓度太高 |
降低一抗/二抗浓度 |
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封闭不完全 |
增加蛋白封闭时间 |
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洗涤不充分 |
增加冲洗次数与时间 |
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可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景 |
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信号弱或无信号 |
无目的蛋白或表达量极少 |
选用表达量高的细胞或组织 |
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细胞通透性差 |
增加通透剂的作用时间或浓度 |
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一抗/二抗浓度太低 |
增大其浓度 |
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二抗选择错误（种属不匹配） |
选用与一抗种属相匹配的二抗 |
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荧光猝灭快 |
荧光素本身特性决定，光稳定性差 |
选用光稳定性好的荧光素二抗 |
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用普通的封片剂封片 |
选用防荧光猝灭剂封片 |
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细胞有自发荧光 |
使用了戊二醛固定 |
在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 |
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材料本身（如石蜡）有自发荧光 |
设立阴性对照，通过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色 |
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细胞成分中能够产生自发荧光的分子（例如核黄素、细胞色素等）的含量高；培养细胞中死细胞／活细胞比例高 |
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问题 |
原因 |
建议 |
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背景过高 |
一抗质量不高 |
使用特异性高、效价高的一抗 |
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一抗/二抗浓度太高 |
降低一抗/二抗浓度 |
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封闭不完全 |
增加蛋白封闭时间 |
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洗涤不充分 |
增加冲洗次数与时间 |
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可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景 |
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信号弱或无信号 |
无目的蛋白或表达量极少 |
选用表达量高的细胞或组织 |
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细胞通透性差 |
增加通透剂的作用时间或浓度 |
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一抗/二抗浓度太低 |
增大其浓度 |
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二抗选择错误（种属不匹配） |
选用与一抗种属相匹配的二抗 |
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荧光猝灭快 |
荧光素本身特性决定，光稳定性差 |
选用光稳定性好的荧光素二抗 |
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用普通的封片剂封片 |
选用防荧光猝灭剂封片 |
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细胞有自发荧光 |
使用了戊二醛固定 |
在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 |
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材料本身（如石蜡）有自发荧光 |
设立阴性对照，通过降低荧光显微镜的参数来消除背景染色 |
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细胞成分中能够产生自发荧光的分子（例如核黄素、细胞色素等）的含量高；培养细胞中死细胞／活细胞比例高 |
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