脱蜡和水化

1.   将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ（10 min）。

2.   再次浸入无水乙醇Ⅰ（5 min）-无水乙醇Ⅱ（5 min）-95%酒精（5 min）-80%酒精（5 min）-70%酒精（5 min），然后去离子水冲洗2次，每次2 min。

抗原修复 (可选)

3.   将组织切片放入修复盒，然后加入适量0.01M枸橼酸缓冲液（pH 6.0）或EDTA修复液（pH 9.0），液面要浸没组织。

4.   微波中档修复10 min（液体沸腾时开始计时），此过程中勿使组织干片。

5.   将修复盒从微波炉中拿出，自然冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，PBS（pH 7.4）冲洗3遍，每次3 min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。

灭活

6.   将配制好的3%的过氧化氢（去离子水稀释30%过氧化氢）滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15 min，PBS冲洗3次，每次3 min。

抗体孵育

7.   吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加5%的正常血清（与二抗种属来源一致或相似），37℃封闭30 min。

8.   用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，用油性笔在组织周围画圈，然后滴加稀释好的一抗，如果做阴性对照实验，就在对照组的组织上滴加PBS。加完一抗后于4 °C湿盒中孵育过夜。（抗体的最佳稀释比应预先通过实验确定，时间控制在15h以上）。

9.   PBS 冲洗切片3次，每次3 min，吸水纸擦干切片后滴加辣根过氧化物酶标记二抗 ，37 ℃孵育30 min。

信号检测

10.   PBS冲洗切片4次，每次3 min，甩去PBS液体后吸水纸擦干切片，每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，时间要控制好，切勿显色过深。用自来水冲洗切片终止显色。

11.   Harris苏木素复染，一般30 s-1 min左右，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用自来水冲洗返蓝。（染核，可选）

脱水固定封片

12. 将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入：70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明，每个试剂中放置2 min，最后在通风橱中风干切片。

13. 将中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上。先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好的切片平躺置于通风橱中晾干。

14. 晾干的切片可以在显微镜下观察或采集图像。