免疫组化(IHC)

石蜡切片免疫组化实验步骤

2017-09-02作者:admin赞:2Protocol下载

脱蜡和水化

1.   将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min,二甲苯Ⅱ(10 min)。

2.   再次浸入无水乙醇Ⅰ(5 min)-无水乙醇Ⅱ(5 min)-95%酒精(5 min)-80%酒精(5 min)-70%酒精(5 min),然后去离子水冲洗2次,每次2 min。

抗原修复 (可选)

3.   将组织切片放入修复盒,然后加入适量0.01M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)或EDTA修复液(pH 9.0),液面要浸没组织。

4.   微波中档修复10 min(液体沸腾时开始计时),此过程中勿使组织干片。

5.   将修复盒从微波炉中拿出,自然冷却降温,当修复液降至室温后取出玻片,PBS(pH 7.4)冲洗3遍,每次3 min(冲洗过程中切勿对着组织冲洗,以免弄破组织)。

灭活

6.   将配制好的3%的过氧化氢(去离子水稀释30%过氧化氢)滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶,室温孵育15 min,PBS冲洗3次,每次3 min。

抗体孵育

7.   吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加5%的正常血清(与二抗种属来源一致或相似),37℃封闭30 min。

8.   用吸水纸擦干玻片组织周围的液体,用油性笔在组织周围画圈,然后滴加稀释好的一抗,如果做阴性对照实验,就在对照组的组织上滴加PBS。加完一抗后于4 °C湿盒中孵育过夜。(抗体的最佳稀释比应预先通过实验确定,时间控制在15h以上)。

9.   PBS 冲洗切片3次,每次3 min,吸水纸擦干切片后滴加辣根过氧化物酶标记二抗 ,37 ℃孵育30 min。

信号检测

10.   PBS冲洗切片4次,每次3 min,甩去PBS液体后吸水纸擦干切片,每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下观察,阳性信号为棕黄色或棕褐色,时间要控制好,切勿显色过深。用自来水冲洗切片终止显色。

11.   Harris苏木素复染,一般30 s-1 min左右,水洗后用1%的盐酸酒精分化,再用自来水冲洗返蓝。(染核,可选)

脱水固定封片

12. 将切片置于水中冲洗后,将切片依次放入:70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明,每个试剂中放置2 min,最后在通风橱中风干切片。

13. 将中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上。先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好的切片平躺置于通风橱中晾干。

14. 晾干的切片可以在显微镜下观察或采集图像。