产品常见问题

为了提供更好的客户支持,我们已经发布了关于Elabscience产品的最常见问题的解答(FAQs)。

  • 标记试剂盒FAQs
  • ELISA FAQs
  • 抗体FAQs
  • 流式FAQs
  • 标记试剂盒FAQs

    1.待标记物有没有什么注意事项?

    待标记物需要有游离伯胺或者N末端,样本中不能含有Tris、甘油、带氨基的蛋白或试剂。

    2.这个生物素标记试剂盒除了标记抗体,可以标记其它蛋白吗?

    生物素标记试剂盒的原理是活化的生物素的酯键和被标记物上的氨基脱水缩合形成稳定的酰胺键。此外,还可以标记蛋白的N末端。如果蛋白上有伯胺,比如赖氨酸就是可以标记的。

    3.这个生物素标记试剂盒标记蛋白的话,是跟抗体一样以20:1的比例反应吗?

    需要考虑蛋白的分子量及带的赖氨酸数量。一般是建议按照2 mg/mL的浓度标记,若带的赖氨酸数量在10-15个左右,可以按照1:20的比例。如果数量较多则把比例加大。

    4.可以小量或者微量标记吗?

    目前说明书的方法是用于标记0.1-2 mg的抗体的,如果需要标记的量更小,我们有专门的微量标记方法,用于标记20-100 μg,反应的体系为100 μL。(所以当标记浓度低于2 mg/mL,需要适当增加生物素的量。)

    5.如何检测标记效率?

    目前出售的生物素标记试剂盒是有优化标记方法的,我们也做过检测,标记效率一般是在90%以上,此外,我们的ELISA试剂盒中的抗体也是使用的生物素标记试剂盒标记的。检测标记效率可以通过生物素定量试剂盒检测标记物的生物素的含量。

    6.生物素标记试剂盒中的超滤管能反复利用吗?

    生物素标记试剂盒里面的截留管可以反复利用,用完了之后要清洗:先加纯水轻轻吹打几次,然后加0.2M的氢氧化钠,泡10 min后离心,然后再用纯水洗,短期保存放在纯水里面就可以,长期的话需要保存在20%乙醇溶液中,使用后的管子不能干燥,要保持湿润(建议不超过3次)。

    7.溶解后的活化生物素保质期多久?

    未开封前的活化生物素冻干粉在4度可以稳定保存一年,但是开封后/溶解后需要密封好,避光4度可保存一周。

    8.蛋白分子量是3.8 kD,用3 kD的截留管合适吗?

    不合适,比如你的蛋白分子量是3.8,你要选择3.8/3以下的截留孔径的管子,不然有滤过或者堵塞孔径的可能。

    9.某某物质(例如叶酸) 是否能标记FITC?

    如果某某物质上有游离伯胺就是可以标记的,若是蛋白需要考虑伯胺(赖氨酸)个数,小分子一般根据氨基个数来确定。 叶酸含氮杂环上含有一个氨基,理论上是可以标记上FITC的,但是这个位点的氨基亲核性比较弱,标记效果可能会不太好,需要客户根据其实验目的来选择做与否。

    ELISA FAQs

    试剂盒

    1.你们的试剂盒能检测什么物种?

    目前我们的试剂盒检测的种属主要为人,小鼠和大鼠,小部分指标涉及猴,兔,猪和鸡等特殊种属。对于那些命名中带有特定物种名称的试剂盒(如人)是专门针对此物种的。如果说明书中没有指明物种,该试剂盒即在常规哺乳动物种属内是通用的。其他特殊种属的检测适用性请联系技术支持确认。

    2.96T试剂盒能检测多少样本?是否需要做复孔?

    96T试剂盒,标准品&样本均不做复孔,最多检测88个样本;标准品做复孔,样本做单孔,最多检测80个样本;标准品做单孔,样本做复孔,最多检测44个样本;标准品&样本均做复孔,最多检测40个样本。如果做3复孔,检测的样本数量会相应减少。
    为了保证实验结果的准确性,我们建议标准品和样品都做复孔,但是并不是要求ELISA实验一定要做复孔/3复孔,客户可根据自己的需求设定复孔实验。

    3.需检测的样品较多,可否减少标曲的孔数?

    为保证结果的准确度,不建议减少标曲的孔数,请至少保证检测 6 个不同的标准品浓度(含空白孔 )。

    4.试剂盒要使用多次,但样本较多,是否可以只做一次标曲?

    虽然 ELISA 的操作步骤是相同的,但每次实验的各种影响因数都是有所变化的,所以每次实验时必须重新制作标准曲线,以便得到更准确可靠的检测结果。如果需要做多次实验,溶解后的最高浓度标准品可以分装保存于-20℃,避免反复冻融,半个月内使用有效。

    样本

    1.血清血浆样本该选用哪种真空采血管收集?

    血清:不含抗凝剂的采血管/含促凝剂采血管。(通常为红色、黄色、橘色管盖的采血管
    血浆:含抗凝剂采血管。(通常为绿色、紫色管盖的采血管 )
    样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(3个月内检测),避免反复冻融。在检测前,冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。

    2.采集时如何尽可能避免溶血现象?

    溶血可由多种理化因素和毒素引起。在体外,如机械性强力振荡、低温冷冻等均可引起溶血。为避免溶血对检测结果的影响,请:
    (1)静脉采血时,回抽压力不宜过大
    (2)一次性采血量不宜过少
    (3)采集的全血不宜激烈振荡
    (4)离心转速不宜过大
    (5)收集的全血需尽快处理成血清/血浆,全血不能冻融
    (6)若需要麻醉采血,需使用没有溶血作用的麻醉剂

    3.组织/细胞样本收集中提到的“反复冻融”过程该如何操作?

    组织样本:组织研磨后,将其-80℃放置1h/液氮放置0.5h,然后置于30℃水浴锅中轻微振荡使其迅速融化,此操作反复1-2次即可。
    细胞样本:按上述反复冻融的操作反复2-3次。若为膜蛋白可以适当超声一下,但需要控制好超声的温度、频率。
    样本中建议提前加入蛋白酶抑制剂。常规推荐:PMSF。

    4.怎样判断我的样本是否需要稀释或者是否需要其他处理?

    试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围,建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果是常规样本类型,可以咨询ELISA技术支持以获取样本的推荐稀释倍数并安排预实验检测。
    如果样品中待测物浓度过高或过低,请对样本做适当的稀释或浓缩。如果样本中的分析物浓度远低于试剂盒的最低检测线,建议选择灵敏度更高的试剂盒来检测。

    数据分析

    1.分析数据最好的方法是什么?是否可以用excel来绘制标曲?

    ELISA 实验中标准品&样品均建议做复孔或三复孔,计算每个浓度标准品的平均 OD 值;将平均 OD 值减去空白孔的 OD 值(竞争法不需要减空白 OD 值)。
    以标准品的浓度为 X 轴,OD 值为 Y 轴,利用作图软件得到合适的拟合曲线并计算样本浓度。推荐使用 Origin 软件,并通过4-PL(4参数logistic)方法拟合得到标准曲线。Excel拟合方式一般为直线和多项式,不推荐其作为ELISA标曲的拟合方法。
    客户可以通过百度下载Origin软件的安装包。
    请扫描下方二维码,在“技术资源-ELISA指南版块”,获取关于Origin计算ELISA实验数据详细信息。

    2.自己做的标曲OD值是否需要跟说明书中的基本一致?

    说明书上的标曲是指示标曲,主要是用于呈现拟合后标曲的形态以及最高/最低OD值的质控范围。而由于受实验操作、实验环境以及仪器参数设定等因素的影响,客户实际做的标曲OD值可能会跟说明书不一致(整体偏高或偏低),这种情况,建议通过在显色阶段控制前4个蓝色孔有明显颜色梯度以及标曲最大OD值在1.2以上,标曲的相关系数在0.99以上即可作为有效标曲。

    抗体FAQs

    1.提供免费的抗体试用装吗?

    一般来说,我们不提供抗体的免费试用装(促销期除外)。详细的促销信息您可以登录我们公司的官网www.elabscience.cn查看,或者咨询我们的销售人员。如果您想验证抗体的特异性,您可以购买我们公司30 μL的小包装,我们公司对小包装的抗体也提供完善的售后服务,以解决您的后顾之忧。

    2.如果抗体的Reactivity中没有包含我实验样本的物种,是否提供售后?

    抗体说明书中提到的物种是确认可以做的,Elabscience不能保证抗体可用于未经验证的物种,即使序列比对同源性高。抗体是否能识别其它物种样本内的蛋白涉及许多因素,我们无法做出预估。如果没有其它的选择,您必须考虑购买抗体用于未验证的物种,我们建议您将免疫原序列与您的目的蛋白序列进行比对,同源性高的话成功的可能性会比较大。如果您购买的抗体是用于未经验证的物种或者实验应用,我们可能不能为您提供更换或者退款。

    3.说明书上的信息是否是最新的准确信息?

    说明书上包含我们该产品的最新信息。如果有新添加或者更新信息,我们网站上的说明书会实时更新,您可以联系我们的技术团队了解有关说明书上遇到的任何问题。

    4.如何选择阳性对照?

    如果您实验需要阳性对照但您无法确认的话可以联系我们的技术团队,我们很高兴为您服务。另外,请确保您使用的细胞系或组织是在说明书上列出的Reactivity范围之内

    5.一抗的使用浓度是多少?

    我们的抗体是浓缩型的,抗体最终使用浓度除了跟抗体本身浓度有关,也跟样本中目的蛋白的丰度有关,所以我们提供的抗体推荐稀释比是一个范围,最终稀释比例是您可以通过预实验确定的,当然您也可以咨询我们的技术团队给您推荐一个合适的稀释比来摸索实验条件。

    流式FAQs

    流式抗体与其他抗体的区别

    1.流式抗体与免疫荧光抗体区别?

    流式抗体是经过流式实验验证的,一般是针对单一种属的直接带荧光标记的单克隆抗体,检测的是单细胞悬液,结果通过流式细胞仪分析。
    免疫荧光抗体是经过免疫荧光实验验证的单克隆或者多克隆抗体,抗体通常情况下一般不带标记,通过FITC、CY3等荧光标记二抗显色,结果通过荧光显微镜观察。

    2.流式抗体与免疫组化抗体区别?

    流式抗体是经过流式实验验证的,一般是针对单一种属的直接带荧光标记的单克隆抗体,检测的是单细胞悬液,结果通过流式细胞仪分析。
    免疫组化抗体是经过免疫组化实验验证的单克隆或者多克隆抗体,抗体通常情况下一般不带标记,通过酶标二抗催化底物显色,结果通过普通光学显微镜观察。

    3.流式细胞术抗体与荧光标记抗体区别?

    流式抗体是经过流式实验验证的,一般是针对单一种属的直接带荧光标记的单克隆抗体,检测的是单细胞悬液,结果通过流式细胞仪分析。
    荧光标记抗体一般指的是带FITC、CY3等荧光标记的二抗,用于免疫荧光实验中识别对应的一抗,或者FITC、CY3标记的荧光一抗,可用于流式或免疫荧光实验,只有经过流式验证的荧光抗体才能称为流式抗体。

    4.流式抗体和普通抗体区别?

    流式抗体是经过流式实验验证的,一般是针对单一种属的直接带荧光标记的单克隆抗体,检测的是单细胞悬液,结果通过流式细胞仪分析。
    普通抗体一般指不带标记的单克隆或者多克隆抗体,反应性和应用一般较广,能做多个种属的多种实验应用,最后实验结果的观察需要依赖酶催化底物显色或者发出荧光后检测,或者FITC、CY3等荧光标记的二抗发出荧光检测。

    5.流式抗体和封闭抗体的区别?

    流式抗体是经过流式实验验证的,一般是针对单一种属的直接带荧光标记的单克隆抗体,检测的是单细胞悬液,结果通过流式细胞仪分析。
    封闭抗体是流式实验中用于特异性封闭细胞表面Fc受体的,不带荧光标记的纯抗,如检测小鼠的细胞样本,封闭抗体为Purified Anti-Mouse CD16/32 Monoclonal Antibody。封闭抗体的作用是减少流式抗体染色过程中的非特异性染色,如果需检测的是某些表面表达FC受体较丰富的细胞,如巨噬细胞,染色前必须使用封闭抗体。

    6.流式抗体和WB抗体区别?

    流式抗体是经过流式实验验证的,一般是针对单一种属的直接带荧光标记的单克隆抗体,检测的是单细胞悬液,结果通过流式细胞仪分析。
    WB抗体是经过WB实验验证的单克隆或者多克隆抗体,抗体上面一般不带标记,通常情况下是通过HRP酶标二抗催化底物ECL发出荧光,通过曝光后显出条带。

    7.流式抗体与二抗的区别?

    流式抗体是经过流式实验验证的,一般是针对单一种属的直接带荧光标记的单克隆抗体,检测的是单细胞悬液,结果通过流式细胞仪分析。
    二抗一般不能直接识别到抗原,需要通过结合能识别目标蛋白的一抗间接偶联到目标蛋白上。针对不同的实验应用类型,二抗上面可以选择不同的标记,如做WB和IHC实验,通常情况下选择带HRP酶的二抗,做IF实验,一般选择带FITC、CY3等荧光基团的二抗,也有些二抗标记biotin,biotin自身并不带荧光集团,也不能催化底物显色或者发出荧光,因此选择biotin标记的二抗,还需要选择HRP酶或者荧光标记的链霉亲和素偶联到生物素上,进一步反应才能检测到目标蛋白。

    流式抗体能做其他实验吗?

    1.流式抗体可以用来做免疫组化么?

    大部分流式抗体质检时验证用的样本是未经固定的正常细胞,免疫组化实验中的样本大多经过固定,固定样本的分子间发生交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露,有些抗原表位会在固定过程中发生改变,导致抗体可能无法识别到抗原表位,所以能做流式实验用的抗体不一定能做IHC,需要通过预实验才能判断。

    2.流式抗体可以用来做免疫荧光么?

    大部分流式抗体质检时验证用的样本是未经固定的正常细胞,免疫荧光实验中的样本大多经过固定,固定样本的分子间发生交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露,有些抗原表位会在固定过程中发生改变,导致抗体可能无法识别到抗原表位,所以能做流式实验用的抗体不一定能做IF,需要通过预实验才能判断。

    3.流式抗体可以用来做WB吗?

    大部分流式抗体质检时验证用的样本是未经固定的正常细胞,蛋白具有空间折叠,WB实验中的样本是经过变性处理的,蛋白的空间结构被破坏,呈线性结构,导致流式实验用的抗体可能无法识别到其抗原表位,所以能做流式实验用的抗体不一定能做WB,需要通过预实验才能判断。

    4.免疫组化抗体可以用来做流式实验吗?

    免疫组化实验中的样本大多经过固定,有些抗原表位会在固定过程中发生改变,大部分流式抗体质检时验证用的样本是未经固定的正常细胞,所以能做IHC实验用的抗体不一定能做流式实验,需要通过预实验才能判断。

    5.免疫荧光抗体可以用来做流式实验吗?

    免疫荧光实验中的样本大多经过固定,有些抗原表位会在固定过程中发生改变,大部分流式抗体质检时验证用的样本是未经固定的正常细胞,所以能做IF实验用的抗体不一定能做流式实验,需要通过预实验才能判断。

    6.WB抗体可以用来做流式实验吗?

    WB实验中的样本是经过变性处理的,蛋白的空间结构被破坏,呈线性结构,大部分流式抗体质检时验证用的样本是未经固定的正常细胞,蛋白处于天然状态,WB抗体所识别的表位可能未暴露出来,所以能做WB的抗体不一定能做流式实验,需要通过预实验才能判断。

    7.普通抗体做流式实验需要注意什么?

    普通抗体做流式实验需要注意目标蛋白特异性和反应种属,明确是否存在交叉反应。实验细胞的数量和抗体的比例要适当,细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响,因此需要优化试验。要明确检测的指标是表面标记还是胞内标记。另外直接标记抗体实验工序少,花费时间短,节省细胞用量,如果条件允许,选用直接荧光标记抗体可以更能保证实验的真实性和准确性。

    流式抗体与同型对照

    1.流式抗体都要同型对照吗?

    一般建议所有流式实验中都使用同型对照抗体作为阴阳性细胞的断定依据,尤其是低表达或连续表达的指标,数据分析的时候不好圈门,同型对照抗体是必不可少的对照,但是对于一些分群明显的指标,如CD3,CD4,CD8等,可以不用做同型对照。

    2.流式抗体同型的用途?

    同型对照抗体作为阴阳性细胞的断定依据,尤其是低表达或连续表达的指标,数据分析的时候不好圈门,同型对照抗体是必不可少的对照。

    3.怎样查流式抗体的同型对照?

    同型对照是与染色的单克隆抗体:
    ①相同种属来源
    ②相同免疫球蛋白及亚型
    ③相同荧光素标记
    ④相同剂量和浓度
    ⑤由未免疫动物血清纯化而来
    用此消除由于抗体非特异性结合到细胞表面Fc受体而产生的背景染色。

    4.流式同型对照的抗体用量?

    同型对照用量需要与染色的单克隆抗体相同剂量和浓度。

    5.流式实验如何设置对照?

    空白对照:用来设定各个通道的电压。
    同型对照:同型对照抗体作为阴阳性细胞的断定依据,尤其是低表达或连续表达的指标,数据分析的时候不好圈门,同型对照抗体是必不可少的对照。
    单染管对照:流式多色实验中,如果各个通道的荧光之间有干扰,需要单独做每个荧光的单染管用来调补偿。
    FMO对照:FMO对照又称为荧光减一对照,指的是多色实验时,要检测某个荧光通道的表达情况,由于荧光渗漏影响占主要,所以检测时先将该通道的抗体去掉,检测一下其它通道漏到此通道的背景荧光水平,进行正确排除,从而帮助设门。

    流式染色问题汇总

    1.流式抗体配色原则和禁忌?

    1.弱表达抗原选择强荧光染料,强表达抗原选择弱荧光染料;
    2.弱表达抗原放在无干扰通道,强表达抗原放在不干扰其它通道的通道;
    3.互相排斥的抗原允许溢漏;
    4.共表达抗原避免溢漏;
    5.允许子代对亲代的溢漏,反之不行;
    6.使分析的复杂程度降到最低。

    2.哪种流式抗体应该显绿色?

    ITC,Alexa Fluor 488,BB515等都是绿色荧光,当样本有GFP自发荧光时,应该避免使用以上几种荧光标记抗体。

    3.流式抗体最快多久染上色?

    样本中加入流式抗体后,一般室温孵育20 min或者4°C孵育30 min即可。

    4.流式抗体染色染多长时间?

    样本中加入流式抗体后,一般室温孵育20 min或者4°C孵育30 min即可。

    5.流式染色需要用到哪些相关试剂?

    有红细胞的样本,需要用到红细胞裂解液,裂解红细胞;
    Fc受体丰富的细胞如巨噬细胞,在加入流式抗体前需要先封闭FC受体,以减少抗体的非特异性结合;
    细胞染色过程中需要使用细胞染色缓冲液;
    胞内指标的检测需要针对胞内指标检测的固定破膜液,核内指标的检测需要针对核内指标检测的固定破膜液;
    对于肿瘤等组织样本进行流式检测的时候,还会用到死细胞染料,在样本制备过程中,为了确保得到单细胞悬液,通常还用使用到胶原酶IV和Dnase I。

    流式抗体用量

    1.流式抗体用量?

    实验用量参考不同公司流式抗体推荐细胞用量,一般以test为单位的抗体,每test对应的细胞量为100μL体积10^6细胞或者100μL全血。对于细胞数量大于这个范围的实验,通常需要实验者自己进行抗体滴定。

    2.流式数据分析需要的细胞数量?

    一般来说,目的细胞群占总细胞比例越低,分析时所需要的细胞数量就越大;我们推荐实验者采集的时候,保证最低比例的细胞群数量达到1000左右。

    3.流式抗体推荐剂量的多少?

    实验用量参考不同公司流式抗体推荐细胞用量,一般以test为单位的抗体,100μL体积10^6细胞或者100μL全血加入1test对应的抗体。以μg为单位的抗体,需要根据厂家推荐的用量做个浓度梯度,确定最佳抗体用量。

    4.流式抗体试剂是不是越多越好?

    流式抗体用量建议根据抗体购买厂家推荐的用量加入或者自己做滴定确定最佳用量,抗体过多或者过少都可能会导致细胞分群不明显。

    5.流式抗体的用量会影响实验结果吗?

    流式抗体用量建议根据抗体购买厂家推荐的用量加入或者自己做滴定确定最佳用量,抗体过多或者过少都可能会导致细胞分群不明显。

    6.流式抗体规格100T是多少毫升?

    需要参考不同厂家的规格设定,test为单位的流式抗体,需要看不同厂家每test对应多少体积,如果是2μL/test,则100T有200μL,如果是5μL/test,则100T有500μL。

    流式抗体保存问题

    1.流式抗体应该如何保存?

    流式抗体一般都是直接带荧光标记的,一般情况下4°C避光可以保存一年,勿-20°C保存,荧光基团在反复冻融之后会从抗体上脱落。

    2.流式抗体过了一年还能用吗?

    一般来说,流式抗体还是比较稳定的,如果说明书上写4°C避光可以保存一年,大部分情况下,过了一年还是可以使用的,有些流式抗体甚至可以4°C避光保存2-3年。

    3.不能及时检测的样本应该如何保存?

    流式实验建议是用新鲜细胞做,样本如果不能及时上机检测,可以在得到单细胞悬液后就立即放到4°C冰箱中,到第二天早上做流式,或尝试抗体染色后,用0.5%多聚甲醛固定15 min后,用PBS洗涤两遍,置于4°C,第二天上机检测,无论是哪种方法,处理不当可能都会造成实验失败的,需要尝试摸索合适的条件。流式实验最好在当天检测,即使要固定的话,也建议在24 h内检测。

    4.-20°C保存再解冻的流式抗体可以使用吗?

    建议解冻的抗体做个预实验看下实验效果,FITC这种比较稳定的荧光,一般情况下冻存对其应用不大,但也要避免反复冻融,串联染料一定要避免冻存。