生物素标记反应原理：

 NH₂-Reactive Biotin专一的与伯胺反应（N-末端及赖氨酸残基侧链）形成稳定的酰胺键

操作过程：

实验前准备：

仔细阅读使用说明书。

计算待使用NH₂-Reactive Biotin的量。

1.  提前20 min从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温（注：不需要用到的NH₂- Reactive Biotin继续放置冰箱中）。

2.  溶解NH₂-Reactive Biotin：加入30 μL DMF至NH₂-Reactive Biotin瓶中，静置10 min，待其充分溶解，此时生物素的浓度为10 mM。

操作步骤：（本操作步骤按照1 mg的量进行标记）

1.  取1 mg待标记抗体于Filtration tube中，并加入相应体积的 Labeling Buffer至总体积为0.5 mL，12,000 × g离心10 min。（注：①Filtration tube的最大体积为0.5 mL。②待标记抗体浓度低时，可先超滤离心一次。）

2.  加入13.3 μL NH₂-Reactive Biotin 和适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使抗体的终浓度为2 mg/mL，并轻轻吹打混匀。放入37℃恒温箱中避光温育30 min。

3.  12,000× g离心10 min。

4.  加入适量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使终体积为0.5 mL，并轻轻吹打混匀，12,000× g离心10 min。并重复操作一次。

5.  加0.2 mL Labeling Buffer至Filtration tube中，轻轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6,000× g离心10 min。

6.  收集离心管中的溶液，即为生物素标记的抗体。

注意事项：

1.  本试剂盒也可标记其它含有氨基（NH₂-）的抗原、HRP、多肽，具体标记比例根据待标记物中氨基的数量确定。

2.  DMF要密封干燥保存，使用完立即用封口膜封紧。

3.  操作步骤5中，可用Labeling Buffer作为回收标记抗体的缓冲液，也可使用其它任何缓冲液或保护剂。

4.  本试剂盒未开封前的有效期为一年，请在有效期内使用。

5.  本试剂盒提供的为10 kDa的Filtration tube，标记抗原或多肽请注意分子量的大小。

6.  在步骤2中，标记其它抗体时，我们应先控制抗体的终浓度为2 mg/mL，然后再根据抗体的量计算应加入NH₂-Reactive Biotin的体积。