凋亡是细胞内的一种“自杀” (self-killing)的现象，而自噬是细胞内的一种“自食” (self-eating) 的现象，今天我们来学习细胞自噬。相关阅读：细胞死亡大盘点-细胞凋亡

一 什么是细胞自噬

细胞自噬（Autophagy）是指细胞内受损、变性或衰老的蛋白质和细胞器在自噬相关基因 (Autophagy associated gene，Atg)的调控下被运输到溶酶体，溶酶体对其消化降解的过程。正常的动物细胞为了维持细胞内环境的动态平衡，需要不断降解功能失常或不需要的细胞结构，通常寿命较短的蛋白质通过泛素-蛋白酶体途径进行降解，而寿命较长的蛋白质及细胞结构则通过自噬途径由溶酶体降解。

图1.细胞自噬过程（图源nobelprize.org）

二 细胞自噬的特征

目前的自噬可分为三类，包括巨自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediated autophagy，CMA），其中巨自噬是最主要，也是研究得最多的形式。细胞自噬的过程主要包括隔离膜（Phagophore）的形成、扩展、自噬体（Autophagosome）的形成、自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体（Autophagolysosome）。自噬溶酶体形成后，内含物被溶酶体中的水解酶消化。

图2.哺乳动物的三种自噬类型

三 细胞自噬的过程

细胞自噬的过程不是一个完全被动的细胞学过程，而是细胞自身在受到外界的刺激通过一系列的细胞内信号转导，触发的一系列细胞维持内环境稳定的一种主动的生物学过程。完整的自噬发生过程大体分为以下4个阶段：自噬的起始→隔离膜和自噬体的形成→自噬体与溶酶体融合→自噬体的裂解。

图3. 细胞自噬的过程（Li et al. Molecular Cancer, 2020）

四 常见细胞自噬的检测方法

检测自噬水平的方法主要有三种：电镜观察、Western Blot检测和荧光蛋白标记检测。

1.电镜观察

透射电子显微镜检测自噬基于辨认自噬体结构，是观察自噬现象的最直接、最经典的方法。

表1. 透射电镜下细胞自噬标志物及其特征

图4. 透射电镜下自噬体（单箭头）和自噬溶酶体（双箭头）形态

2.Western Blot

1）自噬过程中，LC3在合成后其C端被切割变成LC3-Ⅰ，散在分布于胞浆内；当自噬体形成LC3-Ⅰ后，与磷脂酰乙\醇胺偶联形成LC3-Ⅱ，定位于自噬体内膜和外膜，并且始终稳定保留，直到与溶酶体融合。因此可利用WB检测LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化以评估自噬的强弱。

2）p62作为自噬的重要受体，主要依赖于自噬途径进行降解。因此，p62的蛋白水平也常常用来指示自噬的降解情况。

图5. WB检测LC3、p62蛋白的表达

3.荧光蛋白标记

1）GFP-LC3

无自噬时，GFP-LC3在胞浆中弥散分布；自噬形成时，GFP-LC3聚集于自噬体膜上。在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，观察到的点状聚集的数目即为自噬体的数量。

自噬体内膜上的LC3在溶酶体中被降解，因此，LC3的整体降解量可以通过GFP-LC3荧光的降低进行流式细胞仪定量检测。

图6.GFP强度因营养饥饿降低，而自噬或溶酶体抑制剂则增强GFP强度

2）RFP-GFP-LC3 双荧光指示系统

溶酶体内的酸性环境导致GFP荧光信号淬灭，而红色荧光蛋白对酸性环境具有很好的耐受性，可以构建RFP-GFP-LC3串联体。自噬形成时，自噬体呈黄色标记（绿色和红色图像重合），自噬溶酶体呈红色标记。

图7. RFP-GFP-LC3 双荧光指示系统

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