黑色素瘤是一种好发于皮肤和黏膜的高度恶性肿瘤，该肿瘤进展程度快、恶性程度高，其高度糖酵解表型及高度侵袭转移性使中晚期治疗面对巨大挑战。因此，采用一种有效的策略，阻断糖酵解途径，提高氧化应激水平，抑制肿瘤的发展、迁移和侵袭，是成功治疗的关键。

本文由Chemical Engineering Journal一作、沈阳药科大学廉鹤供稿，从改变黑色素瘤细胞代谢及生物学行为角度出发，创新性构筑仿生矿化 LND-BSA@FePO₄纳米反应器，用于实现多效协同治疗策略。

LND-BSA@FePO₄在模拟体液中可实现LND及Fe³⁺的有效释放，Fe³⁺可进一步发生级联催化反应，消耗还原性谷胱甘肽生成Fe²⁺，继而与H₂O₂发生芬顿反应生成·OH。

图1. (A)Fe³⁺与GSH生成Fe²⁺以及Fe²⁺与过氧化氢之间的Fenton反应的机理。(B) LND释放。在磷酸缓冲溶液(C)和柠檬酸缓冲溶液(D)中，Fe³⁺释放。(E)采用DTNB法检测到不同浓度的LND-BSA@FePO₄存在下的GSH消耗量。(F)MB降解检测·OH产生。(H)以TMB为探针，检测·OH的产生。(n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)

LND-BSA@FePO₄在细胞水平的抗肿瘤效果。B16细胞经过不同浓度的LND-BSA@FePO₄及其对照组培养12小时后，细胞死亡率与孵育浓度成正相关趋势，且LND-BSA@FePO₄组的细胞杀伤作用最强，细胞增殖半抑制浓度为22.8 μg/mL，在最高给药浓度点细胞几乎完全死亡（图2A-E）。进一步采用Calcein-AM/PI 双染法对活细胞和死细胞进行荧光染色，在LND-BSA@FePO₄组中出现明显的红色荧光，而绿色荧光信号几乎完全消失，表明多效协同效应诱导的B16细胞的致死率最高（图2F）。

图2.（A-C）经不同组别处理后B16细胞的存活情况；（D）B16 细胞最高死亡率；（E）各组细胞 IC50 值；（F）活/死细胞荧光染色情况。(n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)

进一步，我们研究了LND-BSA@FePO₄的抗肿瘤机制。LND-BSA@FePO₄中的LND作为己糖激酶（HK2）抑制剂调节糖酵解途径，切断细胞能量和生物合成的供应来源。为了验证肿瘤细胞糖酵解能力的变化，我们检测了细胞和培养基中的葡萄糖含量。LND对HK2的抑制导致细胞严重饥饿，进一步导致细胞葡萄糖摄取反馈增加，随着制剂浓度的增加，胞内葡萄糖含量累积而培养基中葡萄糖浓度降低（图3A、B）。然而此时的肿瘤细胞失去了利用葡萄糖的能力，我们使用L-乳酸（LA）比色法试剂盒（货号E-BC-K044-S，Elabscience Biotechnology Co.,Ltd）对细胞上清培养基中的乳酸水平进行检测，B16细胞经不同浓度的LND-BSA@FePO₄培养12小时后，上清液培养基中的乳酸含量随制剂浓度的增加而减少，当给药浓度达到75 μg/mL时，培养基中细胞外排乳酸的含量降低至对照组的24.03%（图3C）。此外，WB分析检测到HK2表达下调，说明了LND-BSA@FePO₄抑制糖酵解的作用（图3D）。

图3. B16细胞经不同浓度的LND-BSA@FePO₄处理后的细胞内（A）及细胞上清培养基（B）中的葡萄糖含量，细胞上清中的乳酸含量（C）；（D）经不同组别处理后HK2表达情况。(n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)

仿生矿化磷酸铁在肿瘤酸性微环境中解离出Fe³⁺，Fe³⁺将还原性谷胱甘肽（GSH）转化为氧化性谷胱甘肽（GSSG），生成的Fe²⁺继续与过氧化氢发生Fenton反应，产生大量剧毒的羟基自由基（⋅OH），上调细胞内氧化应激水平，促进铁死亡的发生。首先使用总铁离子比色法试剂盒（货号E-BC-K772-M，Elabscience Biotechnology Co.,Ltd）分析细胞中的铁总量，总铁离子含量随着制剂浓度和孵育时间的增加而增加（图4 A、B）。此外，我们还检测到胞内GSH含量降低，脂质氧化产物MDA含量增多（图4C、D）。我们还探究了氧化应激的关键指标，细胞内总抗氧化能力下降，ROS产生增多，氧化应激相关蛋白Nrf2和HO-1在B16细胞中的表达均上调，表明细胞内氧化应激升高（图4 E-G）。接下来，WB分析检测到铁死亡关键蛋白GPX4下调，证明LND-BSA@FePO₄有效诱导铁死亡。

图4.（A）不同浓度的LND-BSA@FePO₄处理后的胞内铁总量；（B）60μg/mL LND-BSA@FePO₄孵育不同时间后的胞内铁总量；（C）胞内GSH含量；（D） 胞内MDA含量；（E） 胞内总抗氧化能力；（F） B16 细胞关键蛋白表达量；（G）不同组别处理后的细胞内ROS水平。（组别1: Control, 2: LND, 3: LND-FeCl₃, 4: LND-Na₃PO₄, 5: BSA@FePO₄, 6: LND-BSA@FePO₄）(n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)

矿化FePO₄解离出的PO₄^3-，可以消耗溶酶体内的大量的H⁺，形成共轭酸HPO₄²⁻，从而提高溶酶体的pH值和渗透压，阻止他们与自噬小体结合，阻止肿瘤保护性自噬，进而加速肿瘤细胞死亡的过程。使用生物透射电镜观察了细胞中的自噬情况，与对照组相比，LND-BSA@FePO₄组自噬小体增加而自噬溶酶体减少，表明自噬途径被有效阻断（图5A）。WB分析中，晚期自噬标志物RAB7表达降低，LC3表达上调，LC3-II/LC3-I增大，内源性LC3-I向脂质形式LC3-II的转化表明肿瘤细胞中自噬小体数量增加，自噬底物p62表达上调，进一步表明自噬受到抑制，导致自噬小体和底物的积累（图5B）。

图5.（A）不同组别处理后的B16细胞的Bio-TEM图像。黄色箭头表示自噬小体，红色箭头表示自噬溶酶体。（B） B16 细胞自噬关键蛋白表达量及灰度分析。（组别1: Control, 2: LND, 3: LND-FeCl₃, 4: LND-Na₃PO₄, 5: BSA@FePO₄, 6: LND-BSA@FePO₄）(n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)

我们构建了 C57BL/6 小鼠皮下移植瘤模型（B16 细胞），用于综合评价纳米体系抗肿瘤效果。与对照组相比，LND-BSA@FePO₄组有显著的抗肿瘤作用，肿瘤体积、肿瘤重量及肿瘤大小均明显降低，肺部转移结节减少，表明LND-BSA@FePO₄能有效抑制黑色素瘤的发展和转移（图6）。

图6.（A）荷瘤鼠培养及处理方案；不同治疗后小鼠的体重（B）、肿瘤体积(C)、肿瘤重量(D)、典型肿瘤组织照片(E)。（F）不同组荷瘤小鼠肺转移的H&E图像。（组别1: Control, 2: LND, 3: LND-FeCl₃, 4: LND-Na₃PO₄, 5: BSA@FePO₄, 6: LND-BSA@FePO₄）(n = 5, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)