大家在做实验的过程中，应该有过这种经历：好不容易千辛万苦通过大数据筛出来个肿瘤里阳性表达的基因，然后通过western blot，qPCR的检测也同样验证了其在癌组织里的表达水平要比癌旁要高很多，然而最后一步做了组织芯片的免疫组化，最后，竟然是“万里江山一片棕”!

这个时候，大家一般都开始怀疑自己哪里做错了，其实，小编偷偷告诉你：你可能是用错免疫组化的方法啦!

免疫组织化学技术(immunohistochemistry)，是一项利用抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而对组织细胞内的目的抗原进行定性、定量、定位分析的技术。

免疫组化三步法的优缺点：

经典且又被大家使用多年的免疫组化方法：S-P法(Streptavidin-Peroxidase)，俗称三步法，是通过链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连结，从而达到信号放大的效果。

这个S-P法是一般是最常用的免疫组化方法，敏感度高高的，操作上面也十分简便。

但是，“万里江山一片棕”的问题就出现在这个方法上面。

三步法使用的二抗上面标记着生物素(Bioten)，再通过利用链霉菌抗生物素蛋白(SA)与生物素极强的亲和力，使连结的过氧化酶催化底物DAB显色，从而达到检测目的。

因此，如果组织内源性生物素过高，这个SA可就抓瞎了，看不清楚谁是二抗，就先通通的全结合上，这样一来，就造成了假阳性显色，那我们看到一片棕色也就不足为奇了，

内源性生物素在肝，肾组织中的含量尤其多，在脾、胰、脑、乳腺、子宫内膜和骨骼肌等组织中也广泛存在，因此，避开内源性生物素的感染，才是解决这个问题的重中之重。

该怎么解决这个问题呢?

很多同学表示：那我们就买个封闭内源性生物素的试剂盒，多加几个步骤，就可以解决了吧。

其实也未尝不可，但是这也会徒增烦恼，在金钱和时间上都不允许啊，因此，学霸姐姐建议你换一种免疫组化的方法：二步法。

免疫组化二步法的优势：

二步法这种说辞也是相对于三步法来定义的，其原理很简单：将多个二抗分子与多个辣根过氧化物酶(HRP)结合在一个大分子聚合物上，再通过与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。

但往往为了更好提高它们的结合能力，我们还需要在一抗孵育结束后使用增强剂来使其抗原更好的暴露出来。利用多聚HRP代替了Bioten，这一招移花接木，从技术上克服了组织内源性生物素造成的非特异性的背景染色。

二步法在避免了生物素干扰的同时，其操作简便、反应敏感迅速，目前已逐步取代S-P法，成为科研实验、临床病理诊断中的主流技术。

推荐——Elabscience二步法免疫组化试剂盒
Elabscience 公司最新推出的二步法免疫组化试剂盒，将二抗的单价Fab片段和过氧化物酶HRP聚合在一起，替代传统方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体结合的信号，既保留了抗体特异性结合抗原的能力，又可有效地避免聚合分子过大而 造成的空间位阻。

IHC试剂盒（E-IR-R213）产品成分：

这个试剂盒可用于检测一抗是Rabbit和Mouse来源的单克隆抗体或多克隆抗体，里面含有的独特的聚合物辅助剂有利于大分子的检测系统更好地结合所检测的一抗分子，这个检测系统是目前已知的灵敏度最高的免疫组化检测系统，大家可以放心使用。

另外，这个试剂盒附带的DAB显色液自带稀释液，避免由于各地方水酸碱度的不同对DAB 显色所造成的影响，让你的实验更加准确。

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