免疫印迹(WB)

Western实验步骤

2017-09-01作者:admin赞:2Protocol下载

样本准备

1. 蛋白提取

所需仪器:匀浆器、RIPA裂解液、PMSF(蛋白酶抑制剂)、磷酸酶抑制剂、剪刀、镊子,消毒酒精棉、PBS、移液器、离心机。

裂解液配制——RIPA裂解液:PMSF=100:1。

1) 组织处理:首先用酒精棉消毒剪刀和镊子,取适量的组织于匀浆器中,用剪刀剪碎加适量的裂解液冰水中匀浆1-4 min。匀浆结束后吸取溶液于EP管中保存备用。(含血液较多的组织可先用PBS清洗后再匀浆)

2) 细胞处理:

A、 贴壁细胞处理:去掉培养基用PBS清洗后加入适量的裂解液裂解细胞,用移液器适当吹打使细胞脱落,大瓶贴壁细胞可以先用胰酶洗脱下来后再裂解,裂解方法仿照悬浮细胞处理。

B、 悬浮细胞的处理:先将悬浮细胞置于EP管中3000 rpm离心5 min去掉上清培养基,每20 μL体系细胞加100 μL裂解液反复吹打至细胞完全破碎。

处理好的样品12000 rpm离心5 min,取上清即为提取的蛋白。置于4 ℃可保存一周,-20℃可保存约2个月,-80 ℃可保存半年。


2. 蛋白浓度的测定: 酶标板,酶标仪、离心机、1 mg/mL BSA蛋白标准液、BCA试剂、PBS。

1) 标准曲线:用BSA和PBS混合总体积为20 μL的溶液做标准曲线,具体操作如下:按照0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0含量稀释BSA蛋白标准品,每个浓度(0、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μLBSA,其余用PBS补齐至20 μL)梯度做一个复孔。

2) 样品稀释测蛋白浓度:10倍稀释法:取18 μLPBS+2 μL样品上清(经上步处理的样品12000 r/min离心5 min后的上清)每个样品做两个复孔。

20倍稀释法:取19 μLPBS+1 μL样品上清,每个样品做两个复孔。

一般细胞蛋白适用于10倍稀释法,组织蛋白适用于20倍稀释法,总体积为20 μL。

3) BCA试剂的配制:BCA A液:B液比例为50:1,此试剂现配现用,注意勿被其他蛋白污染。

4) 待标准曲线和样品复孔加样后,每孔加入200 μL的BCA混合试剂,置于37 ℃温箱内15 min。用酶标仪在568nm波长下测得OD值。测得的标准曲线OD值按浓度梯度(两个孔)取其平均值减去空白后制作标准曲线得到曲线公式。测得的样品的OD值(三个孔)取其平均值按标准曲线的公式运算得到蛋白浓度,按50 μg/上样孔的标准来计算上样量,算法为:上样量=50/蛋白浓度。注:所有得到的OD值必须减去背景(标曲中空白孔的OD值)后再计算。


3. 样品处理:

蛋白样品:5×SDS上样缓冲液按照4:1比例混合沸水浴10 min左右。浓度过高的样品可用PBS稀释后再煮样。样品煮好后-20 ℃保存待用(可保存半年),样品长期保存须置于-70 ℃。


实验步骤

1. 凝胶配制

蛋白分子量(kDa

分离胶浓度(%

>140

6%

100-140

8%

30-100

10%

10-30

12%

<10

15%

1) 根据目的蛋白分子量按比例配制分离胶,缓慢摇动混匀,避免由于剧烈混匀混入氧气。待凝胶溶液混合均匀后,将混匀的凝胶溶液缓慢注入两层玻璃板中,再在液面上小心注入一层无水乙醇,以阻止氧气接触凝胶溶液影响凝胶的聚合,保持水平,在37 ℃恒温箱中静置约1小时,直至凝胶溶液完全聚合凝固。

2) 按比例配制浓缩胶,缓慢摇动混匀,倒掉分离胶上层无水乙醇并用滤纸吸去已凝固分离胶上的无水乙醇,平缓注入浓缩胶溶液,小心插入梳子,避免齿尖产生气泡。在37 ℃恒温箱中静置约1 h,直至凝胶溶液完全聚合凝固,小心拔出梳子,准备上样。

2. 上样

向电泳槽中加入电泳缓冲液,要求两块玻璃内侧电泳液高于上样孔,外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部,玻璃板内侧液面高于外侧,根据测得浓度计算的样本上样量点样(已处理好的样品,蛋白预染Marker),保证每孔总蛋白量在30-50 μg,确保总上样量体系小于30 μL,注意上样时间尽量短,避免样品扩散。

3. 电泳

上样后,盖好电泳槽的盖子,注意正负极,并选择适当的电压进行电泳。通常在不连续的系统中,上层浓缩胶的电泳电压(建议80 V)要低于分离胶电泳电压(建议110-150 V),以达到更好的浓缩效果,使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳,电泳时间约2-3小时。


4. 电转(湿转法)

1) 电泳结束后取出凝胶,在电泳缓冲液中(冷藏的)漂洗数秒。按“三明治”模式,打开电转印夹,每侧垫上一块专用的转膜液浸泡透的海绵垫,再各放一块转膜液浸透的蛋白转移垫(定性滤纸),将凝胶平放在阴极侧滤纸上,最后将转膜液浸透并事先用甲醇浸泡的PVDF膜平放在凝胶上,去除气泡,夹好电转印夹,注意PVDF膜与胶,PVDF膜与滤纸,滤纸与胶之间不可有气泡。

2) 转印槽加满转膜缓冲液,插入电转印夹,将转印槽放入冰水中,确保PVDF膜靠近正极,带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。

3) 转膜选择恒流,每个转印槽建议电流为150-300 mA,时间依据目的蛋白条带分子量大小做适当调整。

4) 转膜结束后,将PVDF膜置于丽春红染色液中,室温5-10分钟即可见红色条带,用洗涤缓冲液洗数次可洗掉红色条带进行后续实验 。

5. 封闭

1) 漂洗印迹膜:使用洗涤缓冲液室温适当漂洗。

2) 取出洗过的印迹膜,放入封闭缓冲液中(5%的脱脂奶粉或5%的BSA),摇床摇动,室温封闭1.5-2小时。

6. 抗体的孵育

主要采用间接法,即先加入未标记的特异性一抗,抗体与膜上的抗原蛋白结合,再加入酶标(过氧化物酶或碱性磷酸酶)二抗进行检测。

1) 向封闭后的印迹膜中加入稀释过的特异性一抗,4 ℃孵育过夜。

2) 洗涤缓冲液洗膜10分钟 ×3次。

3) 加入稀释后酶标二抗,室温孵育1小时,洗膜3-6次,每次10分钟。

7. 检测

根据标记二抗的标记物的不同,其结果检测方法也不同,常用的检测系统有化学发光检测(ECL)和化学显色DAB检测系统。

化学发光检测(ECL):

1.  利用HRP催化化学发光物质,生成一种不稳定的中间物质,其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带,利用X胶片感光

原理,将结果记录下来。

2.         ECL显色试剂配制:化学发光底物A和B按照1:1比例等体积混匀。

3.         将混合好的显色底物覆盖印迹膜1-5 min,黑暗条件下观察荧光效果。

4.         在暗室可用放射自显影胶片或化学发光成像系统记录结果 。

5.         如采用放射自显影胶片,曝光几秒到数分钟,根据荧光强度控制曝光时间,以显影效果确定所测抗原的正确曝光时间。曝光完的胶

片先在显影液中浸泡至出现条带为止,再放入定影液中固定影像,胶片最后用清水冲洗干净,挂起晾干。

DAB检测:

1.    1.   按照1 mL水加显色剂A、B、C各一滴混匀。

2.   显色:将适量的DAB显色液平铺在杂交后的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕黄色蛋白条带。




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