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流式课堂|Treg细胞简介及指标选择
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Th1/Th2/Th17和Treg细胞是流式实验中常见的T细胞检测对象，往期的流式课堂给大家介绍了Th1/Th2/Th17细胞简介及指标选择 ，今天给大家简要介绍Treg细胞，并讲解其检测指标及实例分析。
01 什么是Treg细胞？
Treg（调节性T细胞，Regulatory T cells）是免疫系统的重要调节细胞，对维持自身耐受性和免疫细胞稳态至关重要，它由胸腺产生后输出至外周，并通过主动调节的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，从而调节机体的免疫力。目前，最常用的鉴别Treg的标志Marker是CD4、CD25、CD127和Foxp3。Treg在免疫耐受、自身免疫病、感染性疾病、器官移植及肿瘤等多种疾病中发挥重要的作用。
02 Treg细胞分类及标志物
根据发育来源，Treg细胞可分两类：
◇一类是天然产生的自然Treg（nTreg），主要在胸腺里分化发育而来，主要包括CD4+Treg细胞。
◇另一类是经诱导产生的适应性Treg（iTreg），是由初始CD4+T细胞（Th0）经抗原刺激后分化发育而来，包括Tr1细胞、Th3细胞和CD8+Treg细胞等多种亚型，肿瘤微环境中的Treg主要就是指iTreg细胞。
图1：Treg细胞发育流程
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分类 |
表型 |
标志物 |
|
|
自然Treg细胞 |
nTreg |
CD4+CD25+ |
Foxp3，LAG-3、neuropilin-1 |
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适应性Treg细胞 |
Tr1 |
CD4+CD25- |
CD25low/variable， CD45RBlow |
|
Th3 |
CD4+CD25+fromCD25- precursors |
CD25low/variable， CD45RBlow，Foxp3+ |
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|
CD8+ Treg |
CD8+CD25+ |
Foxp3+，CD28- |
|
03 Treg细胞检测指标选择
要检测Treg细胞，应当如何选择指标呢？根据过往的实验经验，为大家进行了如下总结：
|
样本物种 |
检测指标 |
|
Human |
CD3, CD4, CD25, Foxp3, CD127(low/-) |
|
Mouse |
CD3, CD4, CD25, Foxp3 |
1.CD3、CD4表达量较高。
2.蓝色表示重要/表达较低的指标，需要搭配强荧光素。
3.FOX和CD127只需选择一个即可，Foxp3为核内因子，检测时需要固定破膜（E-CK-A108）；CD127是细胞表面Marker，则不需要固定破膜。
04 Treg细胞检测案例
小鼠脾脏Treg（3色）检测
Panel Design&样本管设置：
|
目的 |
样本 |
设置 |
|
调电压 |
1 |
Blank（空白管） |
|
调补偿 |
2 |
CD4-FITC |
|
3 |
CD25-APC |
|
|
4 |
Foxp3-PE |
|
|
APC-FMO联合同型对照划门 |
5 |
CD4-FITC、Foxp3-PE、Rat IgG1, κ Isotype Control-APC |
|
PE-FMO联合同型对照划门 |
6 |
CD4-FITC、CD25-APC、Mouse IgG1, κ Isotype Control-PE |
|
Full Panel |
7 |
CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE |
流式抗体信息：
|
指标 |
荧光标记 |
克隆号 |
货号 |
|
CD4 |
FITC |
GK1.5 |
E-AB-F1097C |
|
CD25 |
APC |
PC-61.5.3 |
E-AB-F1102E |
|
Foxp3 |
PE |
3G3 |
E-AB-F1238D |
|
Rat IgG1, κ Isotype Control |
APC |
HRPN |
E-AB-F09822E |
|
Mouse IgG1, κ Isotype Control |
PE |
MOPC-21 |
E-AB-F09792D |
图2.小鼠脾脏Treg（3色）检测结果
如上图所示，根据FSC/SSC圈出淋巴细胞群，去除粘连体之后，根据CD4+圈出CD4+T淋巴细胞群，最后通过CD25+Foxp3+确定Treg细胞群。
注意事项：
1. 小鼠Treg的标记是CD4+CD25+Foxp3+。
2.CD4分群明显，无需同型对照，CD25和Foxp3分群不明显，需同型对照。
3.荧光素间有溢漏，故需要设置单阳管用于调节补偿。
4.破膜剂使用不当会造成很高的背景以及细胞分群不明显。
人外周血Treg（6色）检测
Panel Design&样本管设置：
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目的 |
样本 |
设置 |
|
调电压 |
1 |
Blank（空白管） |
|
调补偿 |
2 |
CD45-Elab Fluor® Violet 450 |
|
3 |
CD3-Elab Fluor® Red 780 |
|
|
4 |
CD4-FITC |
|
|
5 |
CD8a-PerCP/Cyanine5.5 |
|
|
6 |
CD25-PE |
|
|
7 |
CD127-Elab Fluor® 647 |
|
|
Full Panel |
8 |
CD45-Elab Fluor® Violet 450、CD3-Elab Fluor® Red 780、CD4-FITC、CD8a-PerCP/Cyanine5.5、CD25-PE、CD127-Elab Fluor® 647 |
流式抗体信息：
|
指标 |
荧光标记 |
克隆号 |
货号 |
|
CD45 |
Elab Fluor® Violet 450 |
HI30 |
E-AB-F1137Q |
|
CD3 |
Elab Fluor® Red 780 |
OKT3 |
E-AB-F1001S |
|
CD4 |
FITC |
RPA-T4 |
E-AB-F1109C |
|
CD8a |
PerCP/Cyanine5.5 |
OKT-8 |
E-AB-F1110J |
|
CD25 |
PE |
BC96 |
E-AB-F1194D |
|
CD127 |
Elab Fluor® 647 |
A019D5 |
E-AB-F1152M |
图3.人外周血Treg（6色）检测结果
如上图所示，根据CD45+和SSC圈出淋巴细胞群，去除粘连体之后，根据CD3+圈出T淋巴细胞群，再根据CD4+CD8-圈出CD4+T淋巴细胞群，最后通过CD25+CD127-/low确定Treg细胞群。
注意事项：
1.传统的通过检测Foxp3鉴定Treg的方法操作相对复杂，且固定破膜步骤对实验者要求较高，目前通常通过CD127来检测人Treg。
2.增加CD45指标，便于淋巴细胞圈门，直接通过CD45和SSC圈出淋巴细胞门，分析CD4+CD25+CD127-/low的细胞比例，正常人外周血中Treg细胞在淋巴细胞中占比为3%~10%。
3.需要设置单阳管用于调节补偿。
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